Summary
Denne protokollen presenterer en unik måte å generere cellekulturer i sentralnervesystemet fra dag 17 musehjerner for nevro (immun) logi forskning. Denne modellen kan analyseres ved hjelp av ulike eksperimentelle teknikker, inkludert RT-qPCR, mikroskopi, ELISA og flowcytometri.
Abstract
Modeller av sentralnervesystemet (CNS) må rekapitulere det komplekse nettverket av sammenkoblede celler som finnes in vivo. CNS består hovedsakelig av nevroner, astrocytter, oligodendrocytter og mikroglia. På grunn av økende innsats for å erstatte og redusere bruk av dyr, har en rekke in vitro cellekultursystemer blitt utviklet for å utforske medfødte celleegenskaper, som tillater utvikling av terapeutiske midler for CNS-infeksjoner og patologier. Mens visse forskningsspørsmål kan løses av menneskebaserte cellekultursystemer, for eksempel (induserte) pluripotente stamceller, har arbeid med humane celler sine egne begrensninger med hensyn til tilgjengelighet, kostnader og etikk. Her beskriver vi en unik protokoll for isolering og dyrking av celler fra embryonale musehjerner. De resulterende blandede nevrale cellekulturer etterligner flere cellepopulasjoner og interaksjoner funnet i hjernen in vivo. Sammenlignet med dagens ekvivalente metoder, etterligner denne protokollen nærmere hjernens egenskaper og får også flere celler, slik at flere eksperimentelle forhold kan undersøkes fra en gravid mus. Videre er protokollen relativt enkel og svært reproduserbar. Disse kulturene er optimalisert for bruk på forskjellige skalaer, inkludert 96-brønnbaserte skjermer med høy gjennomstrømning, 24-brønnsmikroskopianalyse og 6-brønnskulturer for flowcytometri og revers transkripsjon-kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) analyse. Denne kulturmetoden er et kraftig verktøy for å undersøke infeksjon og immunitet i sammenheng med noe av kompleksiteten til CNS med bekvemmeligheten av in vitro-metoder .
Introduction
Å forbedre vår forståelse av sentralnervesystemet (CNS) er avgjørende for å forbedre terapeutiske muligheter for mange nevroinflammatoriske og nevrodegenerative sykdommer. CNS, et komplekst nettverk av sammenkoblede celler i hjernen, ryggmargen og optiske nerver, består av nevroner, oligodendrocytter, astrocytter og deres medfødte immunceller, mikroglia1. En in vitro-tilnærming kan ofte drastisk redusere antall mus som kreves for å utføre meningsfull forskning; Den komplekse naturen til CNS gjør det imidlertid umulig å rekapitulere in vivo-situasjonen ved hjelp av cellelinjer. Blandede nevrale cellekulturer gir et ekstremt verdifullt forskningsverktøy for å undersøke nevrologiske spørsmål i en relevant modell, i trådmed prinsippene Replacement, Reduction and Refinement (3Rs) 2,3.
Thomson et al. beskrev en cellekulturmetode ved bruk av prenatale ryggmargsceller som skiller seg ut i alle de nevnte CNS-celletypene4. Dette systemet har også synapsedannelse, myeliniserte aksoner og noder av Ranvier. Hovedbegrensningen til denne dyrkingsmetoden er at den, som ryggmarg, ikke er nyttig modell av hjernen, og celleutbyttet fra embryonale dag 13 (E13) ryggmargene er sammentrekkende. Dermed begrenser dette antall eksperimentelle forhold som kan undersøkes. Derfor hadde denne studien som mål å utvikle et nytt cellekultursystem som rekapitulerer hjernens egenskaper med økt celleutbytte for å redusere kravene til dyr.
Ved å bruke Thomson et al. som utgangspunkt, utviklet vi en cellekulturmodell avledet rent fra prenatale musehjerner. Disse kulturene har samme cellepopulasjoner, sammenkobling og behandlingsmuligheter som ryggmargskulturer, bortsett fra at det er mindre myelinisering til sammenligning. Imidlertid er det mer effektivt å ha en CNS in vitro-modell med omtrent tre ganger høyere celleutbytte, noe som krever færre mus og mindre tid på å behandle embryoer. Vi optimaliserte dette unike kultursystemet for flere nedstrøms applikasjoner og vekter, inkludert bruk av glassdeksel for mikroskopianalyse og forskjellige størrelser av plastbrønnplater, inkludert 96-brønnplater for forskning med høy gjennomstrømning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk fulgte lokale lover og retningslinjer for dyrebruk, og ble godkjent av den lokale etiske vurderingskomiteen ved University of Glasgow. Dyrene ble plassert under spesifikke patogenfrie forhold i samsvar med UK Animals Scientific Procedures Act 1986, i regi av en britisk Home Office Project License. For denne studien ble internavlet voksne C57BL/6J-mus brukt. Bruk av unge kvinner (8-12 uker) anbefales på grunn av graviditetens høyere suksessrate; Hanner kan gjenbrukes til flere runder med avl. Figur 1 representerer en skjematisk oversikt over den beskrevne metoden for å generere blandede nevron- og gliakulturer.
1. Fremstilling av forbruksvarer for vevskultur
- Klargjør tallerkener og/eller tallerkener som inneholder mikroskopideksler inne i et sikkerhetsskap i klasse 2. Steriliser alle reagenser eller autoklav for å sikre sterilitet i kulturperioden.
- Tilsett passende volum BA-PLL (13,2 μg / ml poly-L-lysinhydrobromid [PLL] i borsyrebuffer [BA] [50 mM borsyre, 12,5 mM natriumtetraborat, pH 8,5]; se materialtabell) til hver brønn (1000 μL / brønn i en 6-brønnplate, 100 μL / brønn i en 96-brønnplate; volumene er oppsummert i tabell 1). For mikroskopideksel, tilsett 20 ml BA-PLL til en 9 cm diameter vevskulturskål som inneholder 200 sterile deksler, og virvle for å fordele jevnt.
- Inkuber ved 37 °C i 1-2 timer.
- Fjern BA-PLL-oppløsningen fra hver brønn eller tallerken som inneholder mikroskopideksler, og vask ved å tilsette 20 ml sterilt vann, virvle dekslene og deretter fjerne vannet. Gjenta dette vasketrinnet tre ganger. For en tallerken som inneholder deksler, la sterilt vann ligge i vevskulturfatet på den endelige vasken for enkelt å fjerne dekslene.
- Fjern så mye væske som mulig med en steril pipette og la den tørke i minst 2 timer til over natten.
- Oppbevar de belagte tallerkenene ved 4 °C i opptil 2 måneder.
MERK: Den fremstilte borsyren med poly-l-lysin (BA-PLL) -løsning kan gjenbrukes opptil tre ganger, og tilsett ny PLL hver gang. Oppbevar BA-PLL ved 4 °C. Retter behandles med BA-PLL, da PLL lar cellene stikke ned og vokse. Uten denne behandlingen vil cellene løfte seg etter ca. 1 uke med kultur og ikke lenger være i stand til å differensiere.
2. Disseksjon av E17 embryonale hjerner
- Hus en eller flere kvinnelige mus med en hannmus. Sjekk hunnene daglig for en slimplugg, noe som indikerer at parring har funnet sted.
MERK: Eventuelle "pluggede" hunnmus må skilles fra hannen for å sikre riktig startdato for drektigheten. Mus kan veies for å bekrefte graviditet eller overvåkes visuelt. - Kast den drektige musen på E17 ved hjelp av egnede metoder i samsvar med lokale dyrevelferdsråd og lover, for eksempel ved å øke konsentrasjonen av karbondioksid (CO2), en dødelig bedøvelsesoverdose eller luksasjon av nakken.
MERK: Den valgte metoden må ikke forstyrre embryoene. For denne studien ble eksponering for en stigende konsentrasjon av karbondioksidgass etterfulgt av bekreftelse av død ved å kutte lårarterien brukt til å kaste gravide dammer. - Plasser den slettede, gravide musen på ryggen på et disseksjonsbrett; Selv om det ikke er nødvendig å feste det, kan det gjøre det lettere for uerfarne forskere. Klem midtlinjen i magen ved hjelp av tang. Bruk skarp saks, kutt opp magen gjennom huden og bukhinnen over midtlinjen fra kjønnsorganene til brystkassen, vær forsiktig så du ikke punkterer livmoren.
- Musen livmoren har to horn, hver vanligvis inneholder ett til fem embryoer. Fjern livmoren som inneholder embryoene fra moren og legg den umiddelbart på is.
- Skjær gjennom eggeplommesekken på siden av morkaken, vær forsiktig så du ikke skader embryoene, og fjern embryoene fra eggeplommesekken.
- Halshugg embryoene umiddelbart. Tilsett de halshuggede hodene i en tallerken med Hanks' balanserte saltløsning (HBSS) uten kalsium (Ca 2+) og magnesium (Mg2+) (HBSS-/-) på is.
MERK: Hvis genotyping er nødvendig, kan man fjerne halen på dette stadiet for genetisk analyse. Når flere genotyper forventes, bør hodene til hvert embryo holdes separat for dyrking. - Bruk vinklet tang, plasser hodet på siden mot venstre.
- Pierce øyet med en kant av tangen, hold haken fast med den andre.
- Start på nakken, rive forsiktig huden i hodebunnen langs midtlinjen mot spissen av snuten.
- Gå inn gjennom ryggmargen, merkbar som en hvit oval, bruk de vinklede tangene til å knekke åpne skallen langs midtlinjen, og utsette hjernen.
- Skrell forsiktig skallen bort på siden som vender oppover, og utsett hjernen.
- Løft hjernen ut av skallen, avhende skallen når hjernen er helt fjernet.
- Bruk tangen, fjern meningene, som er merkbare som en tynn membran med tette blodkar.
- Plasser hjernen i en bijou (se materialfortegnelse) som inneholder 2 ml HBSS-/- på is.
- Gjenta trinn 2,6 til 2,13 med de gjenværende hjernene, og legg til opptil fire hjerner per bijou.
- Tilsett 250 μL 10x trypsin til bijou og triturere hjernen ved å riste bijou. Inkuber i 15 minutter ved 37 °C.
MERK: Alle trinn fra dette punktet fremover skal utføres i en steril vevskulturhette. - Tine 2 ml soyabønnetrypsin (SD)-hemmer (Leibovitz L-15, 0,52 mg/ml trypsinhemmer fra soya, 40 μg/ml DNase I, 3 mg/ml bovint serumalbumin [BSA] fraksjon V; se materialfortegnelse) fra -20 °C ved å plassere den ved 37 °C.
- Legg til 2 ml SD-hemmer til hver bijou som inneholder hjerner (per bijou som inneholder opptil fire hjerner), rist bijou igjen for å spre den jevnt.
MERK: SD-hemmer reduserer trypsinaktiviteten for å forhindre unødvendig fordøyelse av prøvene og bevare cellens levedyktighet. - Uten sentrifugering, fjern 2 ml av supernatanten fra hver bijou og overfør til et 15 ml sentrifugerør, og pass på at du ikke overfører celleklumper.
- Triturer de resterende cellene i bijou med en 19 G nål festet til en 5 ml sprøyte ved å aspirere suspensjonen to ganger. Dette vil skape en tykk slimlignende blanding.
- Gjenta to ganger til med en 21 G kanyle. Hvis det er klumper igjen, triturer igjen med 21 G nålen.
- Overfør cellene fra bijou til det samme 15 ml sentrifugerøret (fra trinn 2.18) ved hjelp av en 23 G nål.
- Sentrifuge ved 200 x g ved romtemperatur (RT) i 5 minutter.
- Fjern all supernatanten med en 5 ml serologisk pipette og overfør den til et annet 15 ml sentrifugerør, og pass på at du ikke forstyrrer den løse pelleten på bunnen som inneholder de nødvendige cellene.
- Sentrifuge supernatanten igjen ved 200 x g ved RT i 5 min.
MERK: Dette trinnet er ikke avgjørende, men hvis man krever mange celler eller har få embryoer, kan man utføre dette trinnet for å gjenopprette så mange celler som mulig fra supernatanten. - Bruk 10 ml pletteringsmedier (PM) (49 % Dulbeccos modifiserte ørnemedium [DMEM], 1 % penicillin/streptomycin [Pen/Strep], 25 % hesteserum, 25 % HBSS med Ca 2+ og Mg2 + [HBSS+ /+]; se materialfortegnelse), kombiner og resuspender de to pelletsene sammen for å skape en helcellesuspensjon.
- Telle cellene ved hjelp av trypan blå og enten en hemocytometer eller digital celleteller, og fortynn cellesuspensjonen med PM til en konsentrasjon på 1,8 x 106 celler / ml.
3. Plettering av cellene
- Legg til det nødvendige volumet av celleopphenget til ønsket format som beskrevet i tabell 1: 1,000 μL per brønn i 6-brønnformat, 50 μL per brønn i 96-brønnformat eller 100 μL per dekkslipp.
- Inkuber i 2-4 timer ved 37 °C med 5%-7% CO2. Sjekk at cellene har festet seg ved hjelp av et omvendt mikroskop.
- Fjern mediet og fyll på med nye differensieringsmedier (DM+: DM- inkludert 10 μg/ml insulin. DM-: DMEM, 1% penn / streptokokker, 50 nM hydrokortison, 10 ng / ml biotin, 2,5 ml 100x N1 media supplement; se Materialfortegnelse). Volumene er beskrevet i tabell 1. Trykk ned eventuelle flytende deksler med en steril pipettespiss.
4. Opprettholde kulturene
MERK: Disse kulturene krever fôring tre ganger i uken for å støtte optimal vekst og differensiering. Kulturene vil nå optimal helse og modenhet for eksperimenter på DIV (days in vitro) 21. Celler kan holdes i kultur i opptil 28 dager, hvoretter kulturen raskt degenererer.
- Tre ganger i uken frem til DIV12, erstatt en del av supernatanten med fersk DM+ ved å fjerne 500 μL per brønn i 6-brønnformat, 50 μL per brønn i 96-brønnformat, eller 500 μL per tallerken som inneholder tre dekkslipp, og tilsett 600 μL per brønn i 6-brønnformat, 60 μL per brønn i 96-brønnformat, eller 600 μL per dekkseddel (tabell 1).
- Tre ganger per uke fra DIV13 og utover, erstatt en del av supernatanten med fersk DM- ved å fjerne 500 μL per brønn i 6-brønnformat, 50 μL per brønn i 96-brønnformat, eller 500 μL per tallerken som inneholder tre dekkslipp, og tilsett 600 μL per brønn i 6-brønnformat, 60 μL per brønn i 96-brønnformat, eller 600 μL per dekkseddel (tabell 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroskopi
Kulturer dyrket på glassdeksel er ideelle for å analysere ved mikroskopi. For å visualisere utviklingen av kulturene ble dekkene festet i 4% paraformaldehyd (PFA) på flere tidspunkter fra DIV0 (når celler var festet) til DIV28. Dyrkningene ble farget for immunfluorescensavbildning som tidligere beskrevet5 ved hjelp av tre ulike fargekombinasjoner: NG2 (umodne oligodendrocytter) og nestin (nevrale stam-/stamceller) som utviklingsmarkører, SMI31 (aksoner), MBP (myelin) og NeuN (nevroncellelegeme) som nevronmarkører, eller CNP (oligodendrocytter), GFAP (astrocytter) og Iba1 (mikroglia) som gliamarkører (figur 2).
De ulike celletypene ble kvantifisert ved hjelp av CellProfiler-pipelines (basert på ′,6-diamidino-2-fenylindol-positiv (https://github.com/muecs/cp/tree/v1.1). Hvert enkelt datapunkt ble generert fra et gjennomsnitt på 10 bilder tatt fra tre coverslips per tidspunkt. For mikroglia, nevroner og oligodendrocytter ble prosentandelen av celletype per 4',6-diamidino-2-fenylindol-positiv (DAPI+) celle beregnet. Det prosentvise synsfeltet ble brukt i stedet for antall celler for å kvantifisere antall astrocytter. Dette skyldtes vanskeligheter med å skille mellom de enkelte cellene da de ofte overlappet hverandre (figur 2M,N). Kulturene nådde topp modenhet og celletetthet ved DIV21, hvoretter kulturene begynte å nedbrytes (figur 2N).
Det er viktig at disse kulturene lett kan behandles med rusmidler, for eksempel potensielle terapier, eller brukes til å spore in vitro-infeksjoner . I dette eksemplet ble kulturer på coverslips overført til en 24-brønnsplate og infisert med det svært nevrotrope viruset Semliki Forest-virus (SFV) (stamme SFV6)6, som uttrykker zsGreen i infiserte celler. En mangfoldighet av infeksjon (MOI-antall viruspartikler lagt til per celle) på 0,05, som titrert på baby hamster nyre (BHK) celler, ble brukt for å sikre lavt nivå infeksjon. Etter 0-72 timer etter infeksjon (hpi) ble dyrkning fiksert i 4 % PFA og farget for analyse med immunfluorescerende bildediagnostikk. Figur 3 illustrerer at SFV, i tråd med in vivo-infeksjon , hovedsakelig infiserer oligodendrocytter og nevroner6.
qRT-PCR
I tillegg til mikroskopi kan disse CNS-kulturene brukes til analyse ved molekylære metoder, for eksempel RT-qPCR av mRNA-responser på behandling. For ytterligere å undersøke den medfødte antivirale responsen ble 6-brønns platekulturer behandlet med en rekke doser av den potente antivirale cytokininterferon beta (IFN-β) i 24 timer. Dyrkning ble lysert med guanidium-tiocyanat/fenol, og RNA ble isolert, omdannet til cDNA og analysert med qPCR som tidligere beskrevet7. Ved hjelp av denne metoden kan differensialuttrykk av mange gener måles. Her ble oppreguleringen av Ccl5 kvantifisert mot husholdningsgenet 18s. CCL5 er et kjemotaktisk cytokin (kjemokin) involvert i den inflammatoriske responsen. IFN-β-behandling resulterte i oppregulering av Ccl5 mRNA i kulturene (figur 4A).
Enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA)
96-brønnformatet av kulturer er et utmerket verktøy for høy gjennomstrømningsscreening av behandlinger. For å undersøke om oppreguleringen av Ccl5 mRNA resulterer i ekspresjon av CCL5-protein, ble CCL5 målt i supernatanten av kulturene av ELISA, i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabell). I dette eksemplet ble 96-brønnkulturer behandlet i duplikater med 27 inkrementelle doser IFN-β for å generere en dose-responskurve (figur 4B). I tråd med det økte mRNA-uttrykket (figur 4A) var det en økning i CCL5 frigjort i supernatanten. Som forventet viser figur 4C en klar sammenheng mellom mRNA og proteinuttrykk.
Flowcytometri
Flowcytometri er et kraftig verktøy for samtidig å undersøke uttrykket av mange intra- og/eller ekstracellulære markører. Imidlertid kan analyse av komplekse, svært interaktive kulturer ved flowcytometri være utfordrende på grunn av celleskade og død når man tar celler fra kultur til en encellesuspensjon for behandling og analyse. Ved å sammenligne en rekke protokoller ved bruk av 0,05% -0,5% trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 1x-10x trypsin uten EDTA og mildt dissosiasjonsreagens, ble det funnet at etter å ha behandlet 6-brønns platekulturer med 0,05% trypsin-EDTA i 10 minutter ved 37 ° C med mild agitasjon, ble cellene løftet med mild triturering for å skape en enkeltcellesuspensjon. Spesielt for flowcytometrisk analyse av CNS-celler er det viktig å være skånsom under cellepreparering, minimere vasketrinn og være nøye med å holde cellene ved 4 °C eller på is til enhver tid.
For å vurdere levedyktigheten og celletypene i denne encellede suspensjonen ble cellene farget med et levedyktig fargestoff og fluorescerende merkede antistoffer mot CD45, CD11b, O4, ACSA-2 og CD24 for å tillate visualisering av hver enkelt cellepopulasjon i kulturene8 (figur 5). Rundt 70% celle levedyktighet ble oppnådd fra denne metoden, i gjennomsnitt ca 2 x 10 6 levedyktige, enkeltceller per6-brønnplate (figur 5C). I tråd med mikroskopiresultatene (figur 2N) var det et stort antall mikroglia, nevroner og astrocytter, mens oligodendrocytter var minst tallrike.
Figur 1 Skjematisk oversikt over beskrevet metode for å generere blandede nevron- og gliakulturer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: E17 CNS-kulturer farget for immunfluorescensavbildning av cellemarkører over tid. Celler ble fiksert med 4% PFA før de ble permeabilisert og farget for å visualisere forskjellige populasjoner. Representative bilder av (A,D,G,J,M) utviklingsmarkørene NG2 (oligodendrocyttforløperceller) og nestin (nevron- og gliaforløperceller), (B,E,H,K,N) nevronmarkørene SMI31 (aksoner), MBP (myelin) og NeuN (nevroncellekropp), og (C,F,I,L,O) gliamarkørene CNP (oligodendrocytter), GFAP (astrocytter) og Iba1 (mikroglia). Skalastenger = 50 μm. (P) Antall DAPI per mm2, n = 3, hver n fra tekniske triplikater på 10 bilder per triplikat. (Q) Celletall som en prosentandel av DAPI+-celler (mikroglia, oligodendrocytter og nevroner) og prosentandel av synsfeltet (astrocytter), n = 3, hver n fra tekniske triplikater på 10 bilder per triplikat. Feilfelt er ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Semliki Forest virus (SFV) smitte av E17 CNS-kulturer over tid. Representative bilder av uinfiserte kontrollkulturer (A,C,E,G) og kulturer infisert med 0,05 MOI SFV (B,D,F,H). Cellene ble infisert i 0-48 timer og farget med CNP (oligodendrocyttmarkør) og NeuN (nevronmarkør) (A-D) eller GFAP (astrocyttmarkør) og Iba1 (mikrogliamarkør) (E-H). Hvite piler indikerer en infisert celle. Denne stammen av SFV uttrykker det grønne fluorescerende proteinet zsGreen for å muliggjøre sporing av virusinfeksjon. Skalastenger = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: CCL5 mRNA og proteinekspresjon av E17 CNS-kulturer etter IFN-β behandling. Cellene ble behandlet i 6-brønns plateformat (mRNA) eller 96-brønns plateformat (protein) i 24 timer med en rekke doser IFN-β. (A) Ekspresjon av Ccl5 mRNA etter behandling med 0-100 ng/ml IFN-β, biologisk n = 2, hver tatt fra tekniske triplikater. (B) CCL5-konsentrasjon i supernatanten etter 0-100 ng/ml IFNβ-behandling, biologisk n = 1, tatt fra tekniske triplikater. (C) Cellulær mRNA Ccl5 oppregulering versus CCL5 proteinkonsentrasjon i supernatanten med log trendline. Feilfelt er ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Flowcytometri gating-strategi for å generere encellepopulasjoner fra E17 CNS-kulturer. Cellene ble dissosiert ved hjelp av 0,05% trypsin-EDTA, farget med passende antistoffer og sortert i individuelle cellepopulasjoner. (AC) Gating strategi for å sortere for levende, enkeltceller. (D) Strategi for å velge for mikroglia (CD45+, CD11b+). (E) Strategi for å velge oligodendrocytter (CD45- CD11b- O4+). (F) Strategi for å sortere etter astrocytter (CD45- CD11b- O4- ACSA-2+ CD24+) og nevroner (CD45- CD11b- O4- ACSA-2- CD24+). (G) Individuelle cellepopulasjoner lagt på hverandre og viser diskrete populasjoner. (H) Individuelle celletyper som en prosentandel av de totale cellene som sorteres, n = 4. Feilfelt er ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Nødvendig format | BA-PLL/brønn | Vann til vask | Volum celler i plating media (PM) for å plate ut | Fyller på medier | Fjern/legg til ved fôringskulturer (3x/uke) |
| 6 brønnformat (9.6cm2) | 1000 μL | 1000 μL | 1000 μL | -400 μL | -500 μL medier |
| +600 μL DM+ | +600 μL DM+/- | ||||
| 96 brønnformat (0,32 cm2) | 100μL | 100 μL | 50 μL | +60 μL DM+ | -50 μL medier |
| +60 μL DM+/- | |||||
| Coverslip i parabolformat | 20 ml per 200 dekksedler | 20 ml | 100 μL per følgeseddel | +600 μL DM+ | -500 μL medier |
| +300 μL PM | +600 μL DM+/- |
Tabell 1: Nødvendige volumer for fremstilling av belagt vevskulturplast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CNS er et komplekst nettverk som spenner fra hjernen ned til ryggmargen og består av mange celletyper, hovedsakelig nevroner, oligodendrocytter, astrocytter og mikroglia1. Siden hver celle har en viktig rolle i å opprettholde homeostase og generere passende svar på utfordringer i CNS 9,10,11, er et kultursystem som inneholder alle disse celletypene et nyttig og allsidig verktøy for å undersøke hvordan hjernen kan reagere på en stimulus. Evnen til å studere disse cellene, og deres interaksjoner, i en in vitro sammenheng betyr at et stort utvalg av teknikker kan brukes til å undersøke ulike eksperimentelle spørsmål enkelt. Vi har skissert en rask og effektiv metode for å skaffe og dyrke de viktigste CNS-celletypene fra den prenatale hjernen, som kan etterligne individuelle cellepopulasjoner i den voksne musehjernen12.
Tidligere etablerte protokoller for generering av CNS-kulturer bruker E13.5 ryggmargen 4,5. I tillegg til å ha en egnet modell for ryggmargen, er det høyst relevant å ha en modell som rekapitulerer hjernen. Derfor ble hjerner fra disse E13.5-musene opprinnelig brukt til å generere CNS-kulturene beskrevet her ved hjelp av samme protokoll. Men etter DIV14 begynte cellene å danne store aggregater med tettpakkede nevroncellelegemer. Mens astrocytter var til stede, er det ikke klart om de var jevnt fordelt. Det er uklart om cellene i sentrum av disse cellelegemene ville motta tilstrekkelig næringsstoffer og oksygen fra kulturmediet som cellene utenfor ville. Når du opplever oksygen og næringsmangel, er nevroner tilbøyelige til å gå gjennom apoptose og frigjøre stresssignaler til gliaceller13, noe som kan føre til en proinflammatorisk fenotype14. Nevrogenese ble antatt å være en sannsynlig årsak til disse tettpakkede aggregatene, og denne fasen avtar ved E1715. Når hjerner fra E17-museembryoer ble brukt, dannet cellene fortsatt nettverk, men klynget seg ikke sammen til de store aggregatene som ble sett i E13.5, og ble derfor ansett som en mer egnet alder for hjernekulturene å bli generert fra.
Den nåværende teknikken resulterer også i et større antall celler oppnådd fra en graviditet (i gjennomsnitt 1 x 10 7 celler / hjerne sammenlignet med 3-4 x 106 celler / ryggmargen)7. For en gjennomsnittlig drektig mus med 8-10 embryoer korrelerer dette med opptil 54 forskjellige eksperimentelle forhold i 6-brønnsplateformatet, eller 150 eksperimentelle betingelser for mikroskopi (sammenlignet med henholdsvis 19 og 64 fra ryggmargen). Som sådan er disse CNS-kulturene et flott verktøy for å redusere det nødvendige antall mus16. Spesielt kan 96-brønnformatet enkelt brukes til analyser med høy gjennomstrømning, for eksempel å muliggjøre screening av legemiddelkandidater før testing på dyr, noe som reduserer antall nødvendige dyr for slike studier. Dette vil forhåpentligvis forbedre den lave suksessraten for å teste CNS-legemidler på dyr og forbedre oversettelsen til kliniske studier på mennesker17,18.
Kulturene når topp modenhet ved DIV21. Celletallene øker til dette tidspunktet, hvoretter cellene begynner å degenerere med avtagende antall av hver type celle. Dette ble målt både ved å se på de kvantifiserte celletallene (figur 2N) og antall pyknotiske kjerner (tette DAPI-flekker) (figur 2M). Mens utviklingsmarkørene nestin og NG2 fortsatt uttrykkes på DIV14 (figur 2G) og DIV21 (figur 2J), skyldes dette at noen av astrocyttene går gjennom astrogliose, som oppregulerer nestin19, mens noen av oligodendrocyttene ikke er fullt modne og derfor fortsatt uttrykker noe NG220. Basert på mikroskopivalideringen uttrykker bare en liten del av cellene fortsatt utviklingsmarkører sammenlignet med de fullt modne cellene ved DIV21 (figur 2I,L); Derfor er kulturene stort sett modne på denne tiden. Merk at in vivo er tettheten av mikroglia svært variabel over murine CNS. Nivået av mikroglia, som definert ved Iba1-uttrykk ved hjelp av mikroskopi, er i den høye enden av denne tettheten i våre kulturer12. Den høye andelen mikroglia som overlever flowcytometriprosedyren skyldes sannsynligvis at mikroglia er mer robust enn andre CNS-celler, som generelt har delikate forlengelser, og derfor er mer sannsynlig å bli skadet under flowcytometripreparering.
Det tar bare 3 uker etter disseksjon før cellene er klare for eksperimentering, noe som er kortere enn de fleste menneskebaserte in vitro-metoder, for eksempel organoider eller induserte pluripotente stamcelleavledede modeller21. Så lenge in vivo-forskning er nødvendig for å sikre sikkerheten til nye legemidler, vil bruk av in vitro-celledyrkingsmetoder som vår hjelpe til med å teste toksisitet og effekt effektivt før testing på dyr, redusere behovet for dyr og forbedre oversettelsen av forskning fra in vitro til in vivo. Forhåpentligvis vil dette etter hvert føre til mer effektiv oversettelse til menneskebaserte kliniske studier også. Til slutt ble disse kulturene opprettet for å tillate studiet av CNS. Mens in vitro-systemer ikke fullt ut kan uttrykke kompleksiteten til CNS, representerer primære celleavledede kulturer mer nøyaktig in vivo CNS-egenskaper22,23. In vitro-tilnærminger kan tillate en mer reduktiv tilnærming til å undersøke CNS i fravær av infiltrerende immunceller24 og blod-hjernebarriereintegriteten25. Å fjerne dette laget av kompleksitet kan gjøre det lettere å avdekke mekanismer. Som sådan er dagens dyrkingssystem et nyttig verktøy for å svare på forskningsspørsmål som utfyller in vivo dyreforskning.
Evnen til å høste, isolere og dyrke CNS-celler har allerede i stor grad forbedret vår forståelse av det medfødte CNS16. Denne artikkelen demonstrerer disseksjonen av E17-musehjerner og den resulterende tritureringen og dyrkingen av cellene for å generere et cellekultursystem som inneholder alle hovedcelletypene i CNS. Flere molekylære teknikker har blitt brukt på disse kulturer, som viser effektiviteten disse kulturer har for å undersøke CNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke medlemmer av Edgar og Linington laboratorier, spesielt Prof. Chris Linington, Dr Diana Arseni, og Dr Katja Muecklisch, for deres råd, nyttige kommentarer, og hjelp med å mate kulturer mens vi setter opp disse kulturer. Spesiell takk går til Dr Muecklisch for å gi utgangspunkt for Cell Profiler rørledninger. Dette arbeidet ble støttet av MS Society (stipend 122) og Yuri og Lorna Chernajovsky stiftelsen til MP; University of Glasgow finansiering til JC og MP; og Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) og Medical Research Council (MRV0109721) til GJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
References
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754 (2019).
- Thomson, C. E., et al. synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system. The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).
- Bijland, S., et al. An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches. F1000Research. 8, 117 (2019).
- Fragkoudis, R., et al. Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus. Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).
- Hayden, L., et al. Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135 (2020).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. Journal of Immunology Research. 2017, (2017).
- Gee, J. R., Keller, J. N. Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).
- Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction. Frontiers in Neuroscience. 16, 867357 (2022).
- Keller, D., Erö, C., Markram, H. Cell densities in the mouse brain: A systematic review. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83 (2018).
- Wang, Y. X., et al. Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents. Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).
- Chen, V. S., et al. Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5. Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. Two decades of new drug development for central nervous system disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).
- Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes. Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).
- Zamanian, J. L., et al.
- Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair. Frontiers in Neuroscience. 8, 133 (2014).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59 (2017).
- Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells. Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).
- Koch, K. S., Leffertt, H. L. Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture. Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).
- Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging. Immunity and Ageing. 19 (1), 45 (2022).
- Daneman, R., Prat, A.
