Summary
Denne protokol præsenterer en unik måde at generere cellekulturer i centralnervesystemet fra embryonale dag 17 musehjerner til neuro(immun)logikforskning. Denne model kan analyseres ved hjælp af forskellige eksperimentelle teknikker, herunder RT-qPCR, mikroskopi, ELISA og flowcytometri.
Abstract
Modeller af centralnervesystemet (CNS) skal rekapitulere det komplekse netværk af sammenkoblede celler, der findes in vivo. CNS består primært af neuroner, astrocytter, oligodendrocytter og mikroglia. På grund af den stigende indsats for at erstatte og reducere brugen af dyr er der udviklet en række in vitro-cellekultursystemer for at udforske medfødte celleegenskaber, som muliggør udvikling af lægemidler til CNS-infektioner og patologier. Mens visse forskningsspørgsmål kan løses af menneskebaserede cellekultursystemer, såsom (inducerede) pluripotente stamceller, har arbejdet med humane celler sine egne begrænsninger med hensyn til tilgængelighed, omkostninger og etik. Her beskriver vi en unik protokol til isolering og dyrkning af celler fra embryonale musehjerner. De resulterende blandede neurale cellekulturer efterligner flere cellepopulationer og interaktioner, der findes i hjernen in vivo. Sammenlignet med de nuværende ækvivalente metoder efterligner denne protokol hjernens egenskaber og samler også flere celler, hvilket gør det muligt at undersøge flere eksperimentelle tilstande fra en gravid mus. Desuden er protokollen relativt let og meget reproducerbar. Disse kulturer er optimeret til brug i forskellige skalaer, herunder 96-brøndbaserede skærme med høj kapacitet, 24-brønds mikroskopianalyse og 6-brøndkulturer til flowcytometri og revers transkriptionskvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR) analyse. Denne kulturmetode er et kraftfuldt værktøj til at undersøge infektion og immunitet inden for rammerne af nogle af kompleksiteten af CNS med bekvemmeligheden ved in vitro-metoder .
Introduction
Forbedring af vores forståelse af centralnervesystemet (CNS) er afgørende for at forbedre terapeutiske muligheder for mange neuroinflammatoriske og neurodegenerative sygdomme. CNS, et komplekst netværk af sammenkoblede celler i hjernen, rygmarven og synsnerverne, omfatter neuroner, oligodendrocytter, astrocytter og deres medfødte immunceller, microglia1. En in vitro-tilgang kan ofte drastisk reducere antallet af mus, der kræves for at udføre meningsfuld forskning; CNS's komplekse karakter gør det imidlertid umuligt at rekapitulere in vivo-situationen ved hjælp af cellelinjer. Blandede neurale cellekulturer giver et ekstremt værdifuldt forskningsværktøj til at undersøge neuro(immun)logiske spørgsmål i en relevant model i overensstemmelse med principperne om udskiftning, reduktion og forfining (3R) 2,3.
Thomson et al. beskrev en cellekulturmetode ved hjælp af prænatale rygmarvsceller, der differentierer sig til alle de førnævnte vigtigste CNS-celletyper4. Dette system har også synapsedannelse, myelinerede axoner og knudepunkter af Ranvier. Hovedbegrænsningen ved denne dyrkningsmetode er, at den ikke med fordel modellerer hjernen, da den er rygmarv, og celleudbyttet fra embryonal dag 13 (E13) rygmarv trækker sig sammen. Dette begrænser således antallet af eksperimentelle forhold, der kan undersøges. Derfor havde denne undersøgelse til formål at udvikle et nyt cellekultursystem, der rekapitulerer hjernens egenskaber med øget celleudbytte for at reducere kravene til dyr.
Med udgangspunkt i Thomson et al. udviklede vi en cellekulturmodel, der udelukkende stammer fra prænatale musehjerner. Disse kulturer har de samme cellepopulationer, sammenkobling og behandlingsmuligheder som rygmarvskulturerne, bortset fra at der er mindre myelinering ved sammenligning. Imidlertid er det mere effektivt at have en CNS in vitro-model med et cirka tre gange højere celleudbytte, hvilket kræver færre mus og mindre tid til behandling af embryoner. Vi optimerede dette unikke dyrkningssystem til flere downstream-applikationer og vægte, herunder brug af glasdæksler til mikroskopianalyse og forskellige størrelser af plastbrøndplader, herunder 96-brøndsplader til forskning med høj kapacitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg overholdt lokale love og retningslinjer for dyrebrug og blev godkendt af den lokale etiske undersøgelseskomité ved University of Glasgow. Dyrene blev anbragt under specifikke patogenfrie forhold i overensstemmelse med UK Animals Scientific Procedures Act 1986 i regi af en britisk Home Office Project License. Til denne undersøgelse blev der anvendt internt opdrættede voksne C57BL/6J-mus. Brug af unge kvinder (8-12 uger) anbefales på grund af den højere succesrate for graviditet; Hannerne kan genbruges til flere avlsrunder. Figur 1 repræsenterer en skematisk oversigt over den beskrevne metode til generering af blandede neuronale og gliakulturer.
1. Fremstilling af forbrugsstoffer til vævskultur
- Forbered tallerkener og/eller tallerkener, der indeholder mikroskopidæksedler, inde i et klasse 2-sikkerhedsskab. Steriliser alle reagenser eller autoklave for at sikre sterilitet i dyrkningsperioden.
- Der tilsættes det passende volumen BA-PLL (13,2 μg/ml poly-L-lysinhydrobromid [PLL] i borsyrebuffer [BA] [50 mM borsyre, 12,5 mM natriumtetraborat, pH 8,5]; se materialetabel) til hvert hul (1 000 μL/hul i en 6-brønds plade, 100 μL/hul i en 96-brøndplade; volumenerne er opsummeret i tabel 1). Til mikroskopidæksler tilsættes 20 ml BA-PLL til en vævskulturskål med en diameter på 9 cm, der indeholder 200 sterile dæksedler, og hvirvler rundt for at fordele jævnt.
- Der inkuberes ved 37 °C i 1-2 timer.
- Fjern BA-PLL-opløsningen fra hver brønd eller skål, der indeholder mikroskopidækselsedler, og vask ved at tilsætte 20 ml sterilt vand, hvirvle dæksedlerne og derefter fjerne vandet. Gentag dette vasketrin tre gange. For en skål, der indeholder dæksedler, skal du efterlade sterilt vand i vævskulturskålen på den endelige vask for let at fjerne dæksedlerne.
- Fjern så meget væske som muligt med en steril pipette og lad den tørre i mindst 2 timer til natten over.
- Opbevar de coatede plader ved 4 °C i op til 2 måneder.
BEMÆRK: Den tilberedte borsyre med poly-l-lysin (BA-PLL) opløsning kan genbruges op til tre gange, idet der tilsættes ny PLL hver gang. BA-PLL opbevares ved 4 °C. Retter behandles med BA-PLL, da PLL tillader cellerne at holde fast og vokse. Uden denne behandling vil cellerne løfte sig efter ca. 1 uges dyrkning og ikke længere være i stand til at differentiere.
2. Dissektion af E17 embryonale hjerner
- Co-house en eller flere hunmus med en hanmus. Kontroller hunnerne dagligt for en slimprop, hvilket indikerer, at parring har fundet sted.
BEMÆRK: Alle "tilsluttede" hunmus skal adskilles fra hannen for at sikre den korrekte startdato for drægtigheden. Mus kan vejes for at bekræfte graviditet eller overvåges visuelt. - Aflive den drægtige mus ved E17 ved hjælp af passende metoder i overensstemmelse med lokale dyrevelfærdsretningslinjer og love, for eksempel ved at hæve kuldioxidkoncentrationen (CO2), en dødelig bedøvelsesoverdosis eller forskydning af halsen.
BEMÆRK: Den valgte metode må ikke forstyrre embryonerne. Til denne undersøgelse blev eksponering for en stigende koncentration af kuldioxidgas efterfulgt af bekræftelse af død ved at skære lårbensarterien brugt til at aflive gravide dæmninger. - Placer den aflivede, gravide mus på ryggen på et dissektionsbræt; Selvom det ikke er nødvendigt at fastgøre det, kan det gøre det lettere for uerfarne forskere. Klem midterlinjen af maven ved hjælp af tang. Brug en skarp saks til at skære maven op gennem huden og bughinden over midterlinjen fra kønsorganerne til brystkassen, og pas på ikke at punktere livmoderen.
- Musens livmoder har to horn, der hver typisk indeholder et til fem embryoner. Fjern livmoderen, der indeholder embryonerne fra moderen, og læg den straks på is.
- Skær gennem æggeblommesækken på siden af moderkagen, pas på ikke at beskadige embryonerne, og fjern embryonerne fra deres æggeblommesæk.
- Halshug straks embryonerne. Tilsæt de afhuggede hoveder i et fad med Hanks' afbalancerede saltopløsning (HBSS) uden calcium (Ca 2+) og magnesium (Mg2+) (HBSS-/-) på is.
BEMÆRK: Hvis genotypebestemmelse er påkrævet, kan man fjerne halen på dette stadium til genetisk analyse. Når der forventes flere genotyper, skal hovederne på hvert embryo opbevares separat til dyrkning. - Brug vinklede tang til at placere hovedet på siden mod venstre.
- Pierce øjet med den ene kant af tangen, hold hagen fast med den anden.
- Start ved nakken, riv forsigtigt hovedbundens hud langs midterlinjen mod spidsen af trynen.
- Indtastning gennem rygmarven, mærkbar som en hvid oval, brug de vinklede tang til at knække kraniet langs midterlinjen og udsætte hjernen.
- Skræl forsigtigt kraniet væk på den side, der vender opad og udsætter hjernen.
- Løft hjernen ud af kraniet, bortskaffe kraniet, når hjernen er helt fjernet.
- Brug tangen til at fjerne meninges, som er mærkbare som en tynd membran med tætte blodkar.
- Placer hjernen i en bijou (se tabel over materialer), der indeholder 2 ml HBSS-/- på is.
- Gentag trin 2.6 til 2.13 med de resterende hjerner, og tilføj op til fire hjerner pr. Bijou.
- Tilsæt 250 μL 10x trypsin til bijou og triturer hjernen ved at ryste bijou. Der inkuberes i 15 minutter ved 37 °C.
BEMÆRK: Alle trin fra dette tidspunkt og frem skal udføres i en steril vævskulturhætte. - Optø 2 ml sojabønnetrypsin (SD)-hæmmer (Leibovitz L-15, 0,52 mg/ml trypsinhæmmer fra sojabønne, 40 μg/ml DNase I, 3 mg/ml bovint serumalbumin [BSA] fraktion V; se materialetabel) fra -20 °C ved at placere det ved 37 °C.
- Tilsæt 2 ml SD-hæmmer til hver bijou, der indeholder hjerner (pr. bijou, der indeholder op til fire hjerner), ryst bijouen igen for at sprede den jævnt.
BEMÆRK: SD-hæmmer nedsætter trypsinaktiviteten for at forhindre unødvendig fordøjelse af prøverne og bevare cellelevedygtigheden. - Uden centrifugering fjernes 2 ml supernatant fra hver bijou og overføres til et 15 ml centrifugeglas, idet man skal passe på ikke at overføre celleklumper.
- Triturer de resterende celler i bijouen med en 19 G kanyle fastgjort til en 5 ml sprøjte ved at opsuge suspensionen to gange. Dette vil skabe en tyk slimlignende blanding.
- Gentag to gange mere med en 21 G kanyle. Hvis der er klumper tilbage, tritureres endnu en gang med 21 G-nålen.
- Cellerne overføres fra bijouen til det samme 15 ml centrifugeglas (fra trin 2.18) ved hjælp af en 23 G kanyle.
- Der centrifugeres ved 200 x g ved stuetemperatur (RT) i 5 min.
- Al supernatanten fjernes med en 5 ml serologisk pipette og overføres til et andet 15 ml centrifugeglas, idet man skal passe på ikke at forstyrre den løse pellet i bunden, der indeholder de nødvendige celler.
- Supernatanten centrifugeres igen ved 200 x g ved RT i 5 min.
BEMÆRK: Dette trin er ikke afgørende, men hvis man har brug for mange celler eller har få embryoner, kan man udføre dette trin for at genvinde så mange celler som muligt fra supernatanten. - Brug 10 ml pletteringsmedier (PM) (49% Dulbeccos modificerede ørnemedium [DMEM], 1% penicillin/streptomycin [Pen/Strep], 25% hesteserum, 25% HBSS med Ca 2+ og Mg2 + [HBSS+ /+]; se materialetabel), og resuspender de to pellets sammen for at skabe en helcellesuspension.
- Tæl cellerne ved hjælp af trypanblåt og enten et hæmocytometer eller digital celletæller, og fortynd cellesuspensionen med PM til en koncentration på 1,8 x 106 celler / ml.
3. Plating cellerne
- Tilføj det krævede volumen af cellesuspensionen til det krævede format som beskrevet i tabel 1: 1.000 μL pr. hul i 6-brøndsformat, 50 μL pr. hul i 96-brøndformat eller 100 μL pr. dækslip.
- Der inkuberes i 2-4 timer ved 37 °C med 5%-7% CO2. Kontroller, at cellerne har klæbet ved hjælp af et omvendt mikroskop.
- Fjern mediet og fyld op med nye differentieringsmedier (DM+: DM- inklusive 10 μg/ml insulin. DM-: DMEM, 1% Pen / Strep, 50 nM hydrocortison, 10 ng / ml biotin, 2,5 ml 100x N1 medietilskud; se Tabel over materialer). Mængderne er beskrevet i tabel 1. Tryk eventuelle flydende dæksedler ned med en steril pipettespids.
4. Vedligeholdelse af kulturerne
BEMÆRK: Disse kulturer kræver fodring tre gange ugentligt for at understøtte optimal vækst og differentiering. Kulturerne vil opnå optimal sundhed og modenhed til forsøg på DIV (dage in vitro) 21. Celler kan opbevares i kultur i op til 28 dage, hvorefter kulturerne hurtigt degenererer.
- Tre gange om ugen indtil DIV12 erstattes en del af supernatanten med frisk DM+ ved at fjerne 500 μL pr. hul i 6-brøndsformat, 50 μL pr. hul i 96-brøndformat eller 500 μL pr. skål indeholdende tre dæksedler og tilføje 600 μL pr. hul i 6-brøndsformat, 60 μL pr. hul i 96-brøndsformat. eller 600 μL pr. fad med dækslip (tabel 1).
- Tre gange om ugen fra DIV13 og fremefter erstattes en del af supernatanten med frisk DM- ved at fjerne 500 μL pr. hul i 6-brøndsformat, 50 μL pr. hul i 96-brøndformat eller 500 μL pr. skål indeholdende tre dæksedler og tilføje 600 μL pr. hul i 6-brøndsformat 60 μL pr. hul i 96-brøndsformat eller 600 μL pr. fad med dækslip (tabel 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroskopi
Kulturer dyrket på glasdæksler er ideelle til at analysere ved mikroskopi. For at visualisere udviklingen af kulturerne blev dæksedlerne fastgjort i 4% paraformaldehyd (PFA) på flere tidspunkter fra DIV0 (når cellerne var fastgjort) til DIV28. Kulturerne blev farvet til immunfluorescensbilleddannelse som tidligere beskrevet5 ved hjælp af tre forskellige farvningskombinationer: NG2 (umodne oligodendrocytter) og nestin (neuronale stamceller / stamceller) som udviklingsmarkører, SMI31 (axoner), MBP (myelin) og NeuN (neuroncellelegeme) som neuronale markører eller CNP (oligodendrocytter), GFAP (astrocytter) og Iba1 (mikroglia) som gliamarkører (figur 2).
De forskellige celletyper blev kvantificeret ved hjælp af CellProfiler-rørledninger (baseret på ′,6-diamidino-2-phenylindol-positiv (https://github.com/muecs/cp/tree/v1.1). Hvert enkelt datapunkt blev genereret ud fra gennemsnitligt 10 billeder taget fra tre coversedler pr. tidspunkt. For mikroglia, neuroner og oligodendrocytter blev procentdelen af celletype pr. 4′,6-diamidino-2-phenylindol-positiv (DAPI+) celle beregnet. Det procentvise synsfelt blev brugt i stedet for antallet af celler til kvantificering af antallet af astrocytter. Dette skyldtes vanskeligheder med at skelne mellem de enkelte celler, da de ofte overlappede hinanden (figur 2M, N). Kulturerne nåede maksimal modenhed og celletæthed ved DIV21, hvorefter kulturerne begyndte at nedbrydes (figur 2N).
Det er vigtigt, at disse kulturer let kan behandles med lægemidler, såsom potentielle behandlinger, eller bruges til at spore in vitro-infektioner . I dette eksempel blev kulturer på dæksedler overført til en 24-brøndplade og inficeret med den stærkt neurotrope virus Semliki Forest virus (SFV) (stamme SFV6)6, som udtrykker zsGreen i inficerede celler. En mangfoldighed af infektion (MOI - antallet af viruspartikler tilsat pr. celle) på 0,05, som titreret på babyhamsternyreceller (BHK), blev brugt til at sikre infektion på lavt niveau. Efter 0-72 timer efter infektion (hpi) blev kulturer fikseret i 4% PFA og farvet til analyse ved immunfluorescerende billeddannelse. Figur 3 illustrerer, at SFV i overensstemmelse med in vivo-infektion hovedsageligt inficerer oligodendrocytter og neuroner6.
qRT-PCR
Ud over mikroskopi kan disse CNS-kulturer anvendes til analyse ved molekylære metoder, såsom RT-qPCR af mRNA-responser på behandling. For yderligere at undersøge det medfødte antivirale respons blev 6-brønds pladekulturer behandlet med en række doser af den potente antivirale cytokininterferon beta (IFN-β) i 24 timer. Kulturer blev lyseret med guanidium-thiocyanat/phenol, og RNA'et blev isoleret, omdannet til cDNA og analyseret med qPCR som tidligere beskrevet7. Ved hjælp af denne metode kan differentiel ekspression af mange gener måles. Her blev opreguleringen af Ccl5 kvantificeret mod husholdningsgenet 18'ere. CCL5 er et kemotaktisk cytokin (kemokin) involveret i det inflammatoriske respons. IFN-β behandling resulterede i en opregulering af Ccl5 mRNA i kulturerne (figur 4A).
Enzymbundet immunosorbentassay (ELISA)
96-brøndsformatet af kulturer er et fremragende værktøj til screeninger med høj gennemstrømning af behandlinger. For at undersøge, om opreguleringen af Ccl5 mRNA resulterer i ekspression af CCL5-protein, blev CCL5 målt i kulturernes supernatant ved hjælp af ELISA i henhold til producentens anvisninger (se materialetabellen). I dette eksempel blev 96-brøndkulturer behandlet i to eksemplarer med 27 inkrementelle doser IFN-β for at generere en dosis-responskurve (figur 4B). I overensstemmelse med den øgede mRNA-ekspression (figur 4A) var der en stigning i CCL5 frigivet i supernatanten. Som forventet viser figur 4C en klar sammenhæng mellem mRNA og proteinekspression.
Flow cytometri
Flowcytometri er et kraftfuldt værktøj til samtidig at undersøge ekspressionen af mange intra- og/eller ekstracellulære markører. Imidlertid kan analyse af komplekse, meget interaktive kulturer ved flowcytometri være udfordrende på grund af celleskader og død, når man tager celler fra kultur til en enkeltcellesuspension til behandling og analyse. Ved at sammenligne en række protokoller ved hjælp af 0,05% -0,5% trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 1x-10x trypsin uden EDTA og blidt dissociationsreagens blev det konstateret, at efter behandling af 6-brøndspladekulturerne med 0,05% trypsin-EDTA i 10 minutter ved 37 ° C med blid omrøring blev cellerne løftet med blid trituration for at skabe en enkeltcellesuspension. Især til flowcytometrisk analyse af CNS-celler er det afgørende at være skånsom under celleforberedelse, minimere vasketrin og være meget omhyggelig med at holde cellerne ved 4 ° C eller på is hele tiden.
For at vurdere levedygtigheden og celletyperne i denne enkeltcellesuspension blev cellerne farvet med et levedygtighedsfarvestof og fluorescerende mærkede antistoffer mod CD45, CD11b, O4, ACSA-2 og CD24 for at muliggøre visualisering af hver enkelt cellepopulation i kulturerne8 (figur 5). Omkring 70% cellelevedygtighed blev opnået ved denne metode, i gennemsnit ca. 2 x 10 6 levedygtige, enkeltceller pr. 6-brøndplade (figur 5C). I overensstemmelse med mikroskopiresultaterne (figur 2N) var der et stort antal mikroglia, neuroner og astrocytter, mens oligodendrocytter var de mindst rigelige.
Figur 1: Skematisk oversigt over den beskrevne metode til generering af blandede neuronale og gliakulturer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: E17 CNS-kulturer farvet til immunfluorescensbilleddannende cellemarkører over tid. Celler blev fikseret med 4% PFA, før de blev permeabiliseret og farvet for at visualisere forskellige populationer. Repræsentative billeder af (A, D, G, J, M) udviklingsmarkører NG2 (oligodendrocytprecursorceller) og nestin (neuronale og gliale forløberceller), (B, E, H, K, N) neuronale markører SMI31 (axoner), MBP (myelin) og NeuN (neuroncellelegeme) og (C, F, I, L, O) GLIAMARKØRER CNP (oligodendrocytter), GFAP (astrocytter) og Iba1 (mikroglia). Skalabjælker = 50 μm. (P) Antal DAPI pr. mm2, n = 3, hver n fra tekniske tredobbelte af 10 billeder pr. tredobbelt. (Q) Celletal som en procentdel af DAPI+ celler (microglia, oligodendrocytter og neuroner) og procentdel af synsfeltet (astrocytter), n = 3, hver n fra tekniske triplikater af 10 billeder pr. triplicat. Fejlbjælker er ± standardfejl i middelværdien (SEM). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Semliki Forest virus (SFV) infektion af E17 CNS kulturer over tid. Repræsentative billeder af ikke-inficerede kontrolkulturer (A,C,E,G) og kulturer inficeret med 0,05 MOI SFV (B,D,F,H). Celler blev inficeret i 0-48 timer og farvet med CNP (oligodendrocytmarkør) og NeuN (neuronmarkør) (A-D) eller GFAP (astrocytmarkør) og Iba1 (mikroglial markør) (E-H). Hvide pile angiver en inficeret celle. Denne stamme af SFV udtrykker det grønne fluorescerende protein zsGreen for at muliggøre sporing af virusinfektion. Skalastænger = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: CCL5 mRNA og proteinekspression af E17 CNS-kulturer efter IFN-β behandling. Celler blev behandlet i 6-brønds pladeformat (mRNA) eller 96-brønds pladeformat (protein) i 24 timer med en række doser IFN-β. (A) Ekspression af Ccl5 mRNA efter behandling med 0-100 ng/ml IFN-β, biologisk n = 2, hver taget fra tekniske triplikater. B) CCL5-koncentration i supernatanten efter 0-100 ng/ml IFNβ-behandling, biologisk n = 1, udtaget fra tekniske triplikater. (C) Cellulær mRNA Ccl5-opregulering versus CCL5-proteinkoncentration i supernatanten med log trendline. Fejlbjælker er ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Flowcytometrigatingstrategi til generering af enkeltcellepopulationer fra E17 CNS-kulturer. Celler blev dissocieret ved hjælp af 0,05% trypsin-EDTA, farvet med passende antistoffer og sorteret i individuelle cellepopulationer. (A-C) Gating strategi til at sortere efter levende, enkelte celler. D) Strategi for udvælgelse af mikroglia (CD45+ CD11b+). (E) Strategi for udvælgelse af oligodendrocytter (CD45-CD11b-O4+). (F) Strategi for sortering efter astrocytter (CD45- CD11b- O4- ACSA-2+ CD24+) og neuroner (CD45- CD11b- O4- ACSA-2- CD24+). (G) Individuelle cellepopulationer overlejret på hinanden, der viser diskrete populationer. (H) Individuelle celletyper i procent af det samlede antal sorterede celler, n = 4. Fejlbjælker er ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Påkrævet format | BA-PLL/brønd | Vand til vask | Volumenceller i pletteringsmedier (PM) til plade ud | Påfyldning af medier | Fjern/tilføj ved fodring af kulturer (3x/uge) |
| 6 brøndformat (9.6cm2) | 1000 μL | 1000 μL | 1000 μL | -400 μL | -500 μL medier |
| +600 μL DM+ | +600 μL DM+/- | ||||
| 96 brønd format (0,32 cm2) | 100μL | 100 μL | 50 μL | +60 μL DM+ | -50 μL medier |
| +60 μL DM+/- | |||||
| Coverslip i parabolformat | 20 ml pr. 200 dæksedler | 20 ml | 100 μL pr. dæksel | +600 μL DM+ | -500 μL medier |
| +300 μL PM | +600 μL DM+/- |
Tabel 1: Nødvendige mængder til fremstilling af coatet vævskulturplast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CNS er et komplekst netværk, der spænder fra hjernen ned til rygmarven og består af mange celletyper, overvejende neuroner, oligodendrocytter, astrocytter og microglia1. Da hver celle har en vigtig rolle i at opretholde homeostase og generere passende svar på udfordringer i CNS 9,10,11, er et dyrkningssystem, der indeholder alle disse celletyper, et nyttigt og alsidigt værktøj til at undersøge, hvordan hjernen kan reagere på en stimulus. Evnen til at studere disse celler og deres interaktioner i en in vitro-sammenhæng betyder, at en lang række teknikker kan anvendes til let at undersøge forskellige eksperimentelle spørgsmål. Vi har skitseret en hurtig og effektiv metode til at opnå og dyrke de vigtigste CNS-celletyper fra den prænatale hjerne, som kan efterligne individuelle cellepopulationer i den voksne musehjerne12.
Tidligere etablerede protokoller til generering af CNS-kulturer bruger E13.5 rygmarv 4,5. Ud over at have en passende model til rygmarven er det yderst relevant at have en model, der rekapitulerer hjernen. Derfor blev hjerner fra disse E13.5-mus oprindeligt brugt til at generere CNS-kulturerne beskrevet her ved hjælp af den samme protokol. Men efter DIV14 begyndte cellerne at danne store aggregater med tæt pakkede neuronale cellelegemer. Mens astrocytter var til stede, er det ikke klart, om de var jævnt fordelt. Det er uklart, om cellerne i midten af disse cellelegemer ville modtage tilstrækkelige næringsstoffer og ilt fra dyrkningsmediet, som cellerne udenfor ville. Når man oplever ilt- og næringsstofmangel, er neuroner tilbøjelige til at gennemgå apoptose og frigive stresssignaler til gliaceller13, hvilket kan føre til en proinflammatorisk fænotype14. Neurogenese blev anset for at være en sandsynlig årsag til disse tæt pakkede aggregater, og denne fase aftager med E1715. Når hjerner fra E17-museembryoner blev brugt, dannede cellerne stadig netværk, men klyngede sig ikke sammen i de store aggregater, der ses i E13.5, og blev derfor betragtet som en mere passende alder for hjernekulturerne at blive genereret fra.
Den nuværende teknik resulterer også i et større antal celler fra en graviditet (i gennemsnit 1 x 10 7 celler / hjerne sammenlignet med 3-4 x 106 celler / rygmarv)7. For en gennemsnitlig drægtig mus med 8-10 embryoner korrelerer dette med op til 54 forskellige forsøgsbetingelser i 6-brønds pladeformatet eller 150 eksperimentelle betingelser for mikroskopi (sammenlignet med henholdsvis 19 og 64 fra rygmarven). Som sådan er disse CNS-kulturer et godt værktøj til at reducere det krævede antal mus16. Især 96-brøndsformatet kan let bruges til analyser med høj kapacitet, såsom at muliggøre screening af lægemiddelkandidater forud for dyreforsøg, hvilket reducerer antallet af krævede dyr til sådanne undersøgelser betydeligt. Dette vil forhåbentlig forbedre den lave succesrate for test af CNS-lægemidler i dyr og forbedre oversættelsen til kliniske forsøg på mennesker17,18.
Kulturerne når maksimal modenhed ved DIV21. Celletal stiger indtil dette tidspunkt, hvorefter cellerne begynder at degenerere med faldende antal af hver celletype. Dette blev målt både ved at se på de kvantificerede celletal (figur 2N) samt antallet af pyknobiske kerner (tætte DAPI-pletter) (figur 2M). Mens udviklingsmarkørerne nestin og NG2 stadig udtrykkes på DIV14 (figur 2G) og DIV21 (figur 2J), skyldes dette, at nogle af astrocytterne gennemgår astrogliose, som opregulerer nestin19, mens nogle af oligodendrocytterne ikke er fuldt modne og derfor stadig udtrykker nogle NG220. Baseret på mikroskopivalideringen udtrykker kun en lille del af cellerne stadig udviklingsmarkører sammenlignet med de fuldt modne celler ved DIV21 (figur 2I, L); Derfor er kulturerne stort set modne på dette tidspunkt. Det skal bemærkes, at in vivo er densiteten af mikroglia meget variabel på tværs af murin CNS. Niveauet af mikroglia, som defineret af Iba1-ekspression ved hjælp af mikroskopi, er i den høje ende af denne tæthed i vores kulturer12. Den høje procentdel af mikroglia, der overlever flowcytometriproceduren, skyldes sandsynligvis, at mikroglia er mere robust end andre CNS-celler, som generelt har sarte forlængelser og derfor er mere tilbøjelige til at blive beskadiget under forberedelse af flowcytometri.
Det tager kun 3 uger efter dissektion, indtil cellerne er klar til forsøg, hvilket er kortere end de fleste menneskebaserede in vitro-metoder, såsom organoider eller inducerede pluripotente stamcelleafledte modeller21. Så længe in vivo-forskning er nødvendig for at sikre sikkerheden ved nye behandlinger, vil anvendelse af in vitro-celledyrkningsmetoder som vores hjælpe med at teste toksicitet og effektivitet effektivt før testning på dyr, reducere behovet for dyr og forbedre oversættelsen af forskning fra in vitro til in vivo. Forhåbentlig vil dette i sidste ende også føre til mere effektiv oversættelse til menneskebaserede kliniske forsøg. I sidste ende blev disse kulturer skabt for at muliggøre undersøgelsen af CNS. Mens in vitro-systemer ikke fuldt ud kan udtrykke CNS' kompleksitet, repræsenterer primære celleafledte kulturer mere præcist in vivo CNS-egenskaber22,23. In vitro-tilgange kan give mulighed for en mere reduktiv tilgang til undersøgelse af CNS i fravær af infiltrerende immunceller24 og blod-hjerne-barrierens integritet25. Fjernelse af dette lag af kompleksitet kan gøre det lettere at optrævle mekanismer. Som sådan er det nuværende dyrkningssystem et nyttigt værktøj til at besvare forskningsspørgsmål, der supplerer in vivo dyreforsøg.
Evnen til at høste, isolere og dyrke CNS-celler har allerede i høj grad forbedret vores forståelse af den medfødte CNS16. Denne artikel demonstrerer dissektionen af E17-musehjerner og den resulterende trituration og dyrkning af cellerne for at generere et cellekultursystem, der indeholder alle de vigtigste celletyper i CNS. Flere molekylære teknikker er blevet anvendt på disse kulturer, hvilket viser effektiviteten af disse kulturer til undersøgelse af CNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke medlemmer af Edgar og Linington laboratorier, især Prof. Chris Linington, Dr. Diana Arseni og Dr. Katja Muecklisch, for deres råd, nyttige kommentarer og hjælp til at fodre kulturerne, mens vi opretter disse kulturer. En særlig tak til Dr. Muecklisch for at have givet startpunkterne for Cell Profiler-rørledningerne. Dette arbejde blev støttet af MS Society (bevilling 122) og Yuri og Lorna Chernajovsky Foundation til MP; University of Glasgow finansiering til JC og MP; og Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) og Medical Research Council (MRV0109721) til GJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
References
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754 (2019).
- Thomson, C. E., et al. synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system. The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).
- Bijland, S., et al. An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches. F1000Research. 8, 117 (2019).
- Fragkoudis, R., et al. Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus. Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).
- Hayden, L., et al. Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135 (2020).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. Journal of Immunology Research. 2017, (2017).
- Gee, J. R., Keller, J. N. Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).
- Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction. Frontiers in Neuroscience. 16, 867357 (2022).
- Keller, D., Erö, C., Markram, H. Cell densities in the mouse brain: A systematic review. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83 (2018).
- Wang, Y. X., et al. Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents. Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).
- Chen, V. S., et al. Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5. Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. Two decades of new drug development for central nervous system disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).
- Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes. Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).
- Zamanian, J. L., et al.
- Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair. Frontiers in Neuroscience. 8, 133 (2014).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59 (2017).
- Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells. Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).
- Koch, K. S., Leffertt, H. L. Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture. Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).
- Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging. Immunity and Ageing. 19 (1), 45 (2022).
- Daneman, R., Prat, A.
