Summary
Skjelettmuskulatur består av flere celletyper, inkludert bosatt stamceller, hver med et spesielt bidrag til muskelhomeostase og regenerering. Her beskrives 2D-kulturen av muskelstamceller og muskelcellenisjen i en ex vivo-setting som bevarer mange av de fysiologiske, in vivo og miljømessige egenskapene.
Abstract
Skjelettmuskulatur er det største vevet i kroppen og utfører flere funksjoner, fra bevegelse til kroppstemperaturkontroll. Dens funksjonalitet og utvinning fra skader avhenger av en rekke celletyper og på molekylære signaler mellom kjernemuskelcellene (myofibre, muskelstamceller) og deres nisje. De fleste eksperimentelle innstillinger bevarer ikke dette komplekse fysiologiske mikromiljøet, og de tillater heller ikke ex vivo-studien av muskelstamceller i hvile, en celletilstand som er avgjørende for dem. Her er en protokoll skissert for ex vivo-kulturen av muskelstamceller med cellulære komponenter i deres nisje. Gjennom mekanisk og enzymatisk nedbrytning av muskler oppnås en blanding av celletyper, som settes i 2D-kultur. Immunofarging viser at innen 1 uke er flere nisjeceller tilstede i kultur sammen med myofibre og, viktigere, Pax7-positive celler som viser egenskapene til hvilende muskelstamceller. Disse unike egenskapene gjør denne protokollen til et kraftig verktøy for celleforsterkning og generering av hvilelignende stamceller som kan brukes til å løse grunnleggende og translasjonsspørsmål.
Introduction
Bevegelse, pust, metabolisme, kroppsstilling og vedlikehold av kroppstemperatur er alle avhengige av skjelettmuskulatur, og funksjonsfeil i skjelettmuskulaturen kan dermed forårsake svekkende patologier (dvs. myopatier, muskeldystrofier, etc.) 1. Gitt sine essensielle funksjoner og overflod, har skjelettmuskulatur trukket oppmerksomheten til forskningslaboratorier over hele verden som streber etter å forstå de viktigste aspektene som støtter normal muskelfunksjon og kan tjene som terapeutiske mål. I tillegg er skjelettmuskulatur en mye brukt modell for å studere regenerering og stamcellefunksjon, da sunn muskel kan fullstendig reparere seg selv etter fullstendig skade og degenerasjon, hovedsakelig på grunn av de bosatte stamceller2; Disse kalles også satellittceller og er lokalisert under basal lamina i periferien av muskelfibrene3.
Kjernecellene i voksen skjelettmuskulatur er myofibrene (lange syncytiale multinukleære celler) og satellittcellene (stamceller med myogent potensial som hviler til en skade aktiverer dem). De sistnevnte cellene er de sentrale cellene i muskelregenerering, og denne prosessen kan ikke forekomme i deres fravær 4,5,6,7. I deres umiddelbare mikromiljø er det flere celletyper og molekylære faktorer som signaliserer til dem. Denne nisjen etableres gradvis gjennom utviklingen og frem til voksen alder8. Voksen muskel inneholder flere celletyper (endotelceller, pericytter, makrofager, fibro-adipogene progenitorer-FAPs, regulatoriske T-celler, etc.) 9,10 og ekstracellulære matrikskomponenter (lamininer, kollagen, fibronektin, fibrilliner, periostin, etc.) 11 som samhandler med hverandre og med satellittcellene i sammenheng med helse, sykdom og regenerering.
Å bevare denne komplekse nisjen i eksperimentelle omgivelser er grunnleggende, men utfordrende. Like vanskelig er det å opprettholde eller gå tilbake til hvile, en celletilstand som er kritisk for satellittceller9. Flere metoder har blitt introdusert for delvis å takle disse utfordringene, hver med sine fordeler og ulemper (detaljert i diskusjonsdelen). Her presenteres en metode som delvis kan overvinne disse to barrierene. Muskler blir først høstet og deretter brutt ned mekanisk og enzymatisk før den heterogene celleblandingen settes i kultur. I løpet av kulturen oppdages mange celletyper av nisje, og satellittceller som har returnert til stillhet, observeres. Som et siste trinn i protokollen presenteres immunfluorescenstrinnene som muliggjør deteksjon av hver celletype ved bruk av universelt aksepterte markører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter overholdt franske og EUs dyreforskrifter ved Institut Mondor de Recherche Biomédicale (INSERM U955), spesielt direktivet 2010/63/UE. Dyrene ble holdt i et kontrollert og beriket miljø ved dyreavdelingene med sertifiseringsnummer A94 028 379 og D94-028-028; De ble kun håndtert av autoriserte forskere og dyrepassere, og de ble visuelt inspisert av dyrehuspersonell for tegn på ubehag i løpet av livet. De ble avlivet ved cervikal dislokasjon før disseksjon. Ingen intervensjonsprosedyrer ble utført i løpet av dyrenes levetid; Dermed var det ikke nødvendig å få godkjenning for prosedyren fra en etisk komité og det franske departementet for høyere utdanning, forskning og innovasjon. Det kreves faktisk ingen etisk klarering for avliving og post mortem-disseksjon i henhold til direktiv 2010/63/UE. Resultatene som presenteres i dette manuskriptet er fra villtype C57BL/6NRj-linjen (se materialfortegnelse) og den transgene Tg:Pax7-nGFP-linjen 12 (avlet av vårt team). Protokollen ble brukt på hann- og hunnmus i alderen 8-12 uker.
1. Reagens og utstyr forberedelse før fordøyelsen
- Spray disseksjonsverktøyene (rett og buet saks, tang, se materialfortegnelsen) med 70% etanol, og tørk dem med papir. Dekk en korkplate med aluminiumsfolie, og hold 10 cm petriskåler (en per dyr) i nærheten. Ha papir og 70% etanol innen rekkevidde.
MERK: På slutten av disseksjonen, skyll disseksjonsverktøyene med vann, spray dem deretter med 70% etanol og tørk dem med papir. - Sett et roterende vannbad til 37 °C, og tilbered fordøyelsesblandingen (20 ml / dyr) ved å kombinere DMEM med 1% penicillin-streptomycin, 0,5 U / ml kollagenase, 3 U / ml dispase (se materialtabellen) og 0,2% BSA i 50 ml rør (er).
- Før fordøyelsen blandes gjennom et 0,22 μm filter i en cellekulturhette.
NOTAT: Det anbefales å tilberede fordøyelsesblandingen frisk hver gang.
2. Reagens og klargjøring av utstyr etter fordøyelsen
- Etter fordøyelsen kan blandingen fryses eller dyrkes. For frysing, lag 10% DMSO: 90% føtal bovint serum (FBS), samt et sett med kryorør (1 ml cellesuspensjon per 2 ml kryorør). For kulturen, lag kulturmedium (DMEM supplert med 1% penicillin-streptomycin, 4 ng / ml bFGF og 20% FBS) og et sett med 8-brønnsplater. Platene må være belagt før plating av cellene (detaljer er gitt i trinn 7.1).
- For farging, lag 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbufret saltvann (PBS) (0,15 ml / brønn av 8-brønnsplaten) og blokkeringsløsning (5% IgG-fritt bovint serumalbumin [BSA] i PBS; 0,15 ml / brønn av 8-brønnplaten).
FORSIKTIG: Ikke pust inn PFA-pulveret. Forbered og håndter det under en kjemisk hette.
3. Disseksjon
- Spray det avlivede dyret med 70% etanol. Lag et horisontalt snitt (venstre side av kroppen til høyre side) med stor saks på nivået av magen, og kutt rundt midjen. Trekk huden av baklemmene for å avdekke musklene (figur 1A).
- Plasser dyret på den aluminiumsfoliebelagte korkplaten, og fest ned motsatt forben og baklem. Fjern raskt alle musklene i baklemmene (foran og bak) i en 10 cm petriskål som legges på is (figur 1B,C). Vær spesielt forsiktig med å fjerne fettvevet fra områdene rundt quadriceps og bakre muskler. Fascia, nerver og sener kan også fjernes på dette tidspunktet hvis dette ikke kompromitterer den totale tiden brukt på disseksjon.
MERK: En optimal disseksjonstid for begge baklemmene bør være rundt 15-20 min. Det anbefales at disseksjonstiden ikke overstiger 30 min. - Legg dråper DMEM til musklene av og til for å holde dem fuktige, men ikke for mye, da dette vil gjøre hakking vanskelig. Gjenta for den andre baklemmen. Når alle musklene til ett dyr er i petriskålen (figur 1D), hakk dem fint med saks i 7-10 minutter for å oppnå et glatt homogenat (figur 1E).
MERK: I denne protokollen brukes DMEM supplert med L-glutamin, pyruvat og 4,5 g / l D-glukose.
Figur 1 Predyrkning av muskel. (A) Huden fjernes for å avsløre bakkroppsmusklene, som beskrevet i trinn 3.1. (B,C) Alle bakkroppsmusklene høstes (B) rundt og (C) mellom knoklene, som beskrevet i trinn 3.2. (D) De høstede musklene plasseres i en 10 cm petriskål på is med DMEM-dråper for å holde dem fuktige, som beskrevet i trinn 3.3. (E) Musklene finhakkes med saks til en glatt pasta oppnås med konsistensen som er avbildet i dette bildet. (F) Et bilde av pelleten etter den endelige sentrifugeringen; Den blå pilen fremhever pelleten, som er mot røret, under den stiplede blå linjen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Fordøyelse
MERK: På slutten av fordøyelsen er det nødvendig med en sentrifuge ved 4 °C, en bøtte med is, tre cellesiler (100 um, 70 um, 40 um) og tre 50 ml rør (per dyr) for seksjon 5.
- Forbered og filtrer fordøyelsesblandingen som beskrevet i trinn 1.2. Hold blandingen på is.
- Når alle musklene er hakket, plasser homogenatet i et 50 ml rør med 20 ml fordøyelsesblanding. Pakk kantene på lokket med fleksibel film for å forhindre lekkasje, og plasser røret i et 37 °C ristende vannbad ved lav til middels hastighet (50 o / min).
- Etter 1 time ved 37 °C, åpne lokket og bland ved å pipettere forsiktig syv ganger opp og ned med en 10 ml pipette for å oppnå en homogen blanding. Påfør ny film rundt lokket, og legg den tilbake i ristende vannbad. Etter 1 time, fjern røret og slå av badekaret.
MERK: For dyrking, bruk denne inkubasjonstiden til å belegge platene som beskrevet i trinn 7.1 før du går til avsnitt 5.
5. Filtrering
- Fyll fordøyelsesslangen med kald DMEM (supplert med 1% penicillin-streptomycin) opp til 50 ml. Bland ved å snu røret tre ganger. Hold DMEM i en isbøtte for de neste trinnene.
- Plasser en 100 μm cellesil på et nytt 50 ml rør. Før den fordøyde blandingen gjennom cellesilen inn i det nye røret. Sentrifuge ved 600 x g i 5 minutter ved 4 °C. Hell ut supernatanten i en beholder for flytende avfall.
- Resuspender pelleten i 1 ml kald DMEM (supplert med 1% penicillin-streptomycin). Fyll røret opp til 50 ml med samme DMEM. MERK: Hvis sentrifugeringen hoppes over, vil neste pellet være vanskeligere å identifisere og vedlikeholde.
- Plasser en 70 μm cellesil på et nytt 50 ml rør. Før den sentrifugerte/resuspenderte blandingen gjennom cellesilen inn i den nye slangen. Sentrifuge ved 80 x g i 5 minutter ved 4 °C.
MERK: Dette trinnet er ikke obligatorisk, men anbefales for å eliminere celleavfall. - Plasser en 40 μm cellesil på et nytt 50 ml rør. Før supernatanten gjennom cellesilen inn i det nye røret. Sentrifuge ved 600 x g i 5 minutter ved 4 °C, hell supernatanten i en beholder for flytende avfall og resuspender pelleten i FBS under kulturhetten. Pelleten er svært liten på dette trinnet (figur 1F).
MERK: Filtrering gjennom 40 μm silen fjerner rusk, noe som vil gi et uspesifikt signal i senere farging av kulturene.
6. (Valgfritt) Frysing
MERK: Seksjon 6 er valgfri. Protokollen kan settes på pause etter filtrering, men dette kan redusere celleoverlevelse og kultursuksess.
- Legg til DMSO for å oppnå et 10% DMSO: 90% FBS-forhold, og overfør til kryorør (1 ml resuspendert pellet per 2 ml kryorør).
- Plasser kryorøret ved -80 °C i en isoporboks over natten. Flytt til -150 °C neste dag for langtidslagring.
MERK: Kortvarig lagring ved -80 °C er også mulig. - Når dyrkingen startes, tines kryorøret raskt i et vannbad på 37 °C til cellesuspensjonen er tint. Bland med 4 ml DMEM under kulturhetten. Spinn ved 600 x g i 5 minutter ved 4 °C. Pipetter ut supernatanten, og fortsett som beskrevet i trinn 7.2.
7. Dyrking
MERK: Fryste eller ferskcellesuspensjoner kan forventes å fylle 24-32 brønner med tre til fire 8-brønnsplater.
- Belegg 8-brønnsplater med overflatebehandlingsløsningen, som skal tines ved 4 °C eller på is (stambeleggsoppløsning holdes normalt ved -20 °C). Tilsett 0,4 ml beleggløsning til en brønn, og pipetter den fra brønn til brønn. Etter overføring av beleggløsningen gjennom alle brønnene, kan den samles opp og fryses på nytt for fremtidige kulturer. Oppbevar de belagte platene ved 37 °C i 30 minutter før plating av cellene.
- Legg til DMEM (supplert med 1% penicillin-streptomycin) supplert med 4 ng / ml bFGF (se materialtabellen) til FBS-cellesuspensjonen for å oppnå et 20% FBS: 80% DMEM-forhold.
MERK: Selv om tilsetning av bFGF kan være gunstig i primære myoblastkulturer og i satellittlignende celleproduksjon i bulkkulturer, er tilsetningen valgfri, da utelatelsen i bulkkulturer på ~ 7 dager ikke alvorlig kompromitterer celleutbyttet. - Plate 0,4 ml av suspensjonen per brønn (fra trinn 7.2) i de belagte 8-brønnplatene.
MERK: Beregn 30 cm2 kultur per dyr for frosne og friske preparater. - Inkuber kulturen ved 37 ° C med 5% CO2 i opptil 10 dager, bytt medium hver dag etter at kulturen begynner å skifte til en gulaktig farge (vanligvis 5-7 dager).
MERK: For å kvantifisere celler i S-fasen av cellesyklusen 13, legg til10 μM EdU 2 timer før fiksering. For å fange den første S-fasen, legg til 10 μM EdU fra pletteringen, og fest ved 40 timers kultur.
8. Fiksering
MERK: §§ 8-10 bør gjennomføres ved romtemperatur med mindre annet er angitt.
- Pipetter ut dyrkningsmediet, og fikser cellene med 4 % PFA (0,15 ml/brønn).
FORSIKTIG: Tilsett PFA under en kjemisk hette.
MERK: Hvis alle brønnene er festet samtidig, inkuber med PFA ved romtemperatur i 10 minutter. Hvis brønnene er festet på forskjellige tidspunkter, tilsett PFA i brønnene som skal festes, og hold platen i inkubatoren ved 37 °C i 5 minutter. - Pipetter ut PFA, og tilsett PBS i 10 s (0,15 ml/brønn). Pipetter ut PBS, og tilsett fersk PBS i 5 minutter (0,15 ml/brønn).
MERK: Hvis alle brønnene er festet samtidig, inkuber med PBS ved romtemperatur. Hvis brønnene er festet på forskjellige tidspunkter, tilsett PBS i de faste brønnene, og hold platen i inkubatoren ved 37 °C i 5 minutter. Deretter legger du til 0,4 ml PBS, og holder platen i inkubatoren i opptil 1 uke.
9. Permeabilisering og blokkering
- Når du er klar til å flekke, pipetter du ut PBS og permeabiliserer med 0,5 % TritonX 100 i PBS (0,15 ml/brønn) i 8 minutter. Pipetter ut TritonX 100, skyll med PBS i 10 s (0,15 ml/brønn), pipetter ut PBS og vask med PBS i 5 minutter (0,15 ml/brønn).
- Blokker med 5% IgG-fri BSA i PBS i 30-60 min (0,15 ml / brønn).
10. Farging
- Pipetter ut BSA, og tilsett den primære antistoffblandingen fortynnet i PBS (0,15 ml/brønn) (se materialfortegnelsen; fortynninger: anti-CD31 1:100, anti-FOSB 1:200, anti-GFP 1:1,000, anti-KI67 1:1,000, anti-MyHC 1:400, anti-MYOD 1:200, anti-MYOG 1:150, anti-PAX7 1:100, anti-PDGFRa 1:50) for inkubasjon over natten ved 4 °C.
MERK: Etter antistoffinkubasjonen, samle antistoffblandingen, tilsett natriumazid og hold ved 4 ° C eller -20 ° C (i henhold til antistoffprodusentens instruksjoner) for fremtidig gjenbruk. - Pipetter ut antistoffblandingen, skyll med PBS i 10 s (0,15 ml/brønn), pipetter ut PBS og vask med PBS i 5 minutter (0,15 ml/brønn).
- Pipetter ut vaske-PBS, tilsett den sekundære antistoffblandingen (geit-anti-mus Alexa Fluor 488, geit-antikanin Alexa Fluor 555, geit-anti-rotte Alexa Fluor 647, geitanti-mus Alexa Fluor 555, geitekylling Alexa Fluor 488, alle brukt ved fortynninger på 1:500-1,000) og kjernemarkør (f.eks. DAPI) fortynnet i PBS (0,15 ml / brønn) (se materialfortegnelse), og inkuber i 1 time ved romtemperatur, beskyttet mot lys.
- Pipetter ut den sekundære antistoffblandingen, skyll med PBS i 10 s (0,15 ml/brønn), pipetter ut PBS, vask med PBS i 5 minutter (0,15 ml/brønn), pipetter ut PBS og monter.
NOTAT: Hvis det brukes 8-brønnsplater med avtagbare separatorer, må du fjerne separatorene før montering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen tillater muskelcellekultur samtidig som satellittcellene og de fleste celler bevares fra deres endogene nisje. Figur 2 oppsummerer hovedtrinnene i protokollen, mens vesentlige deler av disseksjonen og fordøyelsen er presentert i figur 1. Disseksjon av bakkroppsmuskulaturen anbefales (figur 1A-C), da denne muskelgruppen er godt studert og deler utviklingsmessig opprinnelse og molekylære hierarkier14. Det anbefales å tilberede alle blandingene under sterile forhold. I tillegg ble lavere kulturforurensning lagt merke til når fordøyelsesblandingen ble ført gjennom et 0,22 μm filter under en cellekulturhette.
Ved plating av 1/30 av en bulkprep på belagte 1 cm2 brønnplater, er langstrakte celler synlige 3-4 dager etter at kulturen har startet. Dette kan imidlertid variere avhengig av cellekonsentrasjonen, og langstrakte celler kan begynne å vises senere, spesielt når man utvider frosne bulkpreparater. Ca. 7 dager senere skal mediet ha blitt gult, og på dette tidspunktet er det nødvendig med daglige middelsendringer. I tillegg, på dette tidspunktet, må brønnene dekkes med myorør. Endotelcellene utgjør en mindre brøkdel av kulturen. Hovedindikasjonen på en vellykket kultur er rikelig med PAX7 + -celler, som kan kreve fiksering og farging. En praktisk musemodell som kan brukes når det er mulig, er Tg:Pax7-nGFP-linjen 12, som muliggjør visualisering av PAX7-positivitet i form av GFP-uttrykk; Dermed kan satellittcellene lett oppdages av reporteren GFP. GFP kan observeres ved 20x forstørrelse på et omvendt epifluorescensmikroskop, og dermed muliggjøre analyse av kulturens suksess mens kulturen pågår. Dette gjør også levende avbildning av PAX7-GFP-celler i bulkkulturer mulig. Kulturer må ikke stå lenger enn 10 dager. Etter det begynner reservecellene å avta i antall, og myorørene kan løsne fra platen. Mislykkede kulturer, inkludert basert på nylig erfaring med kulturer fra frosne celler, kan fortsatt generere en stor andel fibre, men svært få PAX7-GFP-celler. Ved bruk av mus uten fluorescerende markør for PAX7, er det nødvendig å utføre farging for å vurdere effekten av reservecellegenerering.
Følgende antistoffer er testet og fungerer godt med fargeprotokollen presentert i protokollseksjon 10: anti-PAX7 (en markør for satellittceller og aktiverte myoblaster 15; også en markør for reserveceller som dukker opp i denne kulturen), anti-myosin (en markør for myorør15), anti-CD31 (en markør for endotelceller16), anti-GFP (hvis reportermus brukes), anti-MYOD (en markør for myoblaster 15), anti-MYOG (en markør for differensierende myocytter 15), anti-KI67 (en markør for prolifererende celler17) og anti-PDGFRα (en markør for FAP15). Figur 3 viser myogene og nisjeceller etter 7 dager i dyrkning. Når det gjelder figur 3A-C, ble muskelbulker dyrket fra villtypemus, mens for figur 3D-F ble muskelbulker dyrket fra den nevnte Tg:Pax7-nGFP-linjen. Dobbeltfarging med PAX7 og KI67 (figur 3A) tillot markering av reservecellene som dukket opp etter 5 dager i kultur og hadde muskelstamcellekarakteristika, for eksempel utgangen fra cellesyklusen (KI67- status) og en lokalisering som "satellitter" til de dannede myotubene. Dobbeltfarging med MyHC og MYOG (figur 3B, D, E) tillot å markere cellene som avanserte gjennom muskeldifferensiering og dermed gradvis uttrykte MYOG og deretter fusjonerte for å danne multinukleerte MyHC + myorør. Farging med CD31 eller PDGFRα tillot merking av nisjeceller (figur 3C), for eksempel endotelceller og FAP-er. Figur 3D, E viser nye reserveceller merket med GFP. Samtidig farging med GFP og MyHC gjorde det mulig å evaluere satellittcelleposisjonen til reservecellene (figur 3E), mens samtidig farging med GFP og andre aktiverings-/differensieringsmarkører tillot å evaluere reservecellenes hvilelignende natur (figur 3F).
Figur 2: En oversikt over protokolltrinnene. (A–D) Sekvensielle trinn av (A) disseksjon, (B) fordøyelse, (C) filtrering og (D) kultur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Immunfarging av cellepopulasjonene. (A) Immunfluorescens av myogene (merket med PAX7; grønn) og syklende (merket med KI67; røde) celler. Kjernene er motfarget med DAPI (blå). Tilstedeværelsen av ikke-syklende myogene celler (KI67-PAX7+) viser at protokollen kan produsere hvilelignende celler fra villtypemus som det er rikelig av ved 7 dagers kultur. (B) Immunfluorescens av myotuber (markert med myosin tungkjede [MyHC]; grønn) og myocytter (merket med MYOG; rød) etter 7 dagers kultur av celler fra villtype mus. Kjernene er motfarget med DAPI (blå). (C) Immunfluorescens av myogene celler (merket med PAX7; grønn), mesenkymale fibro-adipogene progenitorer (merket med PDGFRa; rød) og endotelceller (merket med CD31; magenta) etter 7 dagers kultur av celler fra villtype mus. Kjerner er motfarget med DAPI (blå). (D) Immunfluorescens av GFP + celler (grønn) og myocytter (merket med MYOG; magenta) etter 8 dagers kultur av celler fra Tg: Pax7-nGFP mus, hvor PAX7-uttrykkende celler er merket av kjernefysisk GFP. (E) Immunfluorescens av GFP+ celler (grønn) og myotuber (merket med MyHC; rød) etter 7 dagers kultur av celler fra Tg:Pax7-nGFP mus. Merk at de satellittcellelignende cellene vises i kulturen etter 7 dager. (F) Kvantifisering av GFP + celleandelen som uttrykker markører for satellittceller (PAX7), aktivering (FOSB), proliferasjon (KI67) eller myogen differensiering (MYOD, MYOG). Feilfeltene angir standardavviket. Skala bar: 100 um. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voksen skjelettmuskelfunksjon støttes av et fint orkestrert sett med cellulære interaksjoner og molekylære signaler. Her presenteres en metode som gjør det mulig å studere disse parametrene i en ex vivo-setting som ligner det fysiologiske mikromiljøet.
Flere grupper har rapportert in vitro-metoder for dyrkning av myogene celler. Disse metodene hadde som mål å isolere satellittceller for å studere deres myogene stamegenskaper. To hovedtilnærminger brukes til å isolere rene satellittceller, enten fra kulturer av isolerte fibre fra soleus og/eller EDL-muskler18eller fra FACS-isolerte satellittceller, fra bulkmuskler, ved hjelp av et panel av antistoffer for Pax7, CD34 og a7-integrin for positiv seleksjon og CD45, CD31 og Sca1 for negativt utvalg 19,20,21. Andre har også brukt mekaniske kraner for å isolere primære myoblaster fra bulkkulturer på gelatinbelagte plater på grunn av deres skjøre adhesjonsegenskaper sammenlignet med andre celler som FAPs22,23. Selv om disse tilnærmingene er egnet for å studere aktiveringen av satellittceller eller for å utvide dem i kultur, vokser cellene i et miljø fratatt støttecellene som vanligvis bidrar til deres nisje. I tillegg krever disse tilnærmingene å holde de myogene progenitorene i mer enn 2 uker for å etablere hvilende mononukleerte reserveceller med høyt Pax7-uttrykk18. Kokulturer av satellittceller og andre celletyper, som makrofager, er også rapportert. Dette har gjort det mulig å studere et spesifikt celles direkte bidrag til myogene egenskaper som proliferasjon, differensiering og fusjon24. Flere enkeltcellede RNA-seq-studier har beskrevet den cellulære sammensetningen av skjelettmuskelen25,26. Da våre kulturforhold favoriserer genereringen av myogene celler, har vi observert en mye høyere andel reserveceller og en lavere andel støtteceller i bulkkulturer sammenlignet med disse in vivo-studiene.
Det er identifisert tre kritiske trinn i metoden beskrevet her som kan øke effektiviteten. For det første er rask og effektiv hakking nødvendig for å sikre optimal muskeldissosiasjon i løpet av 2 timer med fordøyelsen og deretter et høyere celleutbytte. For det andre er kontinuerlig rotasjon under fordøyelsen svært viktig for å sikre riktig diffusjon av enzymer gjennom vevet. Til slutt er mild mekanisk dissosiasjon også viktig for optimal vevsdissosiasjon.
Det er fire hovedbegrensninger i denne protokollen. For det første forblir det et ex vivo-system, noe som betyr at noen fysiologiske og biofysiske signaler kan gå tapt eller endres. Dette inkluderer signalering til / fra muskelfibrene, da fibrene går tapt før plating, og myorørene gjenoppbygges under kultur. For det andre gjenstår det å se om de dannede myorørene har embryonale eller voksne egenskaper, og om de representerer de forskjellige fibertypene i langsomme og raske muskler. Til referanse har kulturer av C2C12 muskelcellelinjen og humane myoblaster vist at myorør i 2D-kultur er mindre modne enn deres in vivo kolleger27,28, mens primære mus myoblastkulturer synes å føre til myosintyper som er representative for de som finnes in vivo 29. For det tredje, med denne metoden, mister cellene sin in situ-posisjon under vevsdissosiasjon, og de nydannede myorørene mangler nevromuskulære og myotendinøse veikryss; Resultater på romlige trekk bør derfor tolkes med forsiktighet. For det fjerde har den presenterte protokollen blitt optimalisert for friske voksne muskler, men tilpasninger kan være nødvendige hvis utgangsmaterialet stammer fra gamle eller myopatiske muskler som presenterer omfattende fibrose, økt adipogen avsetning eller kompromittert celleaktivering.
De fleste av disse begrensningene er felles for andre metoder for ex vivo muskelstudier, men denne protokollen har flere fordeler i forhold til dem. Det er den eneste protokollen som tillater høsting av et stort antall hvilelignende reservesatellittceller. I tillegg representerer den en billig og grei metode som ikke krever de spesielle kulturbetingelsene eller ekspertisen som er forbundet med induserte pluripotente stamceller, embryonale stamceller, myosfærekultur eller organoidkultur. Videre er bulkkulturen ikke avhengig av den kompliserte infrastrukturen og standardiseringen som er forbundet med kulturer av myogene celler i hydrogeler eller andre stillas. Sammenlignet med kulturer av isolerte myofibre, FACS-isolerte primære celler eller preplating-berikede primære celler, bevarer bulkkulturen flere cellepopulasjoner som er tilstede i det fysiologiske muskelmiljøet. Disse cellene passerer gjennom en relativt fysiologisk vei for aktivering og differensiering drevet av kulturmediets vekstfaktorer i stedet for de ekstreme og uvanlige signalene fra slangegiftene som vanligvis brukes til å studere muskelregenerering in vivo30,31. Endelig er den presenterte cellekulturen fordelaktig over bruk av C2C12-celler, som, som med hvilken som helst cellelinje, har genetiske endringer sammenlignet med endogene eller primære celler.
Ovennevnte fordeler gjør denne protokollen til et kraftig verktøy for applikasjoner som celleforsterkning og generering av et hvilelignende satellittcellebasseng, som er nødvendige for å utvikle celleterapier eller til og med svare på grunnleggende spørsmål om ro og cellulær / molekylær regulering. I tillegg kan protokollen brukes til å modifisere molekylær signalering via legemidler, siRNA-målretting eller transfeksjon med vektorer (plasmid, virus) som induserer overekspresjon eller uttrykk for dominerende negative former av interessefaktorene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Til figur 2 ble det brukt maler fra Servier Medical Art (https://smart.servier.com/). FR-laboratoriet støttes av Association Française contre les Myopathies - AFM via TRANSLAMUSCLE (tilskudd 19507 og 22946), Fondation pour la Recherche Médicale - FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), Agence Nationale pour la Recherche - ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) og La Ligue Contre le Cancer (IP / SC-17130). Ovennevnte finansiører hadde ingen rolle i utformingen, innsamlingen, analysen, tolkningen eller rapporteringen av denne studien eller skrivingen av dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
| anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
| anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
| anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
| anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
| anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
| anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
| anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
| anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
| Bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
| BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
| Cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
| Cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
| Cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
| Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
| Culture plate | Sarstedt | 94.6140.802 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
| Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
| Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
| Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
| EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
| Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
| Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
| Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
| Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
| Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Forcina, L., Cosentino, M., Musarò, A. Mechanisms regulating muscle regeneration: Insights into the interrelated and time-dependent phases of tissue healing. Cells. 9 (5), 1297 (2020).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- McCarthy, J. J., et al. Effective fiber hypertrophy in satellite cell-depleted skeletal muscle. Development. 138 (17), 3657-3666 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Hicks, M. R., Pyle, A. D. The emergence of the stem cell niche. Trends in Cell Biology. 33 (22), 112-123 (2022).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Gama, J. F. G., et al. Role of regulatory T cells in skeletal muscle regeneration: A systematic review. Biomolecules. 12 (6), 817 (2022).
- Loreti, M., Sacco, A. The jam session between muscle stem cells and the extracellular matrix in the tissue microenvironment. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 16 (2022).
- Sambasivan, R., et al. Distinct regulatory cascades govern extraocular and pharyngeal arch muscle progenitor cell fates. Developmental Cell. 16 (6), 810-821 (2009).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Bismuth, K., Relaix, F. Genetic regulation of skeletal muscle development. Experimental Cell Research. 316 (18), 3081-3086 (2010).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: From the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Abou-Khalil, R., Le Grand, F., Chazaud, B. Human and murine skeletal muscle reserve cells. Stem Cell Niche. 1035, 165-177 (2013).
- Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2011).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Qu, Y., Edwards, K., Barrow, J. Isolation, culture, and use of primary murine myoblasts in small-molecule screens. STAR Protocols. 4 (2), 102149 (2023).
- Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: Background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2011).
- Saclier, M., Theret, M., Mounier, R., Chazaud, B. Effects of macrophage conditioned-medium on murine and human muscle cells: analysis of proliferation, differentiation, and fusion. Methods in Molecular Biology. 1556, 317-327 (2017).
- Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Molecular Cell. 74 (3), 609-621 (2019).
- Tabula Muris Consortium et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Brunetti, J., Koenig, S., Monnier, A., Frieden, M. Nanopattern surface improves cultured human myotube maturation. Skeletal Muscle. 11 (1), 12 (2021).
- Denes, L. T., et al. Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation. Skeletal Muscle. 9 (1), 17 (2019).
- LaFramboise, W. A., et al. Effect of muscle origin and phenotype on satellite cell muscle-specific gene expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (10), 1307-1318 (2003).
- Azhar, M., Wardhani, B. W. K., Renesteen, E. The regenerative potential of Pax3/Pax7 on skeletal muscle injury. Journal of Generic Engineering and Biotechnology. 20 (1), 143 (2022).
- Hardy, D., et al. Comparative study of injury models for studying muscle regeneration in mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
