Summary
Skelettmuskulaturen består av flera celltyper, inklusive stamceller, var och en med ett särskilt bidrag till muskelhomeostas och regenerering. Här beskrivs 2D-odlingen av muskelstamceller och muskelcellnischen i en ex vivo-miljö som bevarar många av de fysiologiska, in vivo- och miljöegenskaperna.
Abstract
Skelettmuskulaturen är den största vävnaden i kroppen och utför flera funktioner, från rörelse till kroppstemperaturkontroll. Dess funktionalitet och återhämtning från skador beror på en mängd olika celltyper och på molekylära signaler mellan kärnmuskelcellerna (myofibrer, muskelstamceller) och deras nisch. De flesta experimentella miljöer bevarar inte denna komplexa fysiologiska mikromiljö, och de tillåter inte heller ex vivo-studier av muskelstamceller i vila, ett celltillstånd som är avgörande för dem. Här beskrivs ett protokoll för ex vivo-odling av muskelstamceller med cellulära komponenter i deras nisch. Genom mekanisk och enzymatisk nedbrytning av muskler erhålls en blandning av celltyper, som sätts i 2D-odling. Immunfärgning visar att inom 1 vecka finns flera nischceller i odling tillsammans med myofibrer och, viktigare, Pax7-positiva celler som uppvisar egenskaperna hos vilande muskelstamceller. Dessa unika egenskaper gör detta protokoll till ett kraftfullt verktyg för cellamplifiering och generering av vilande stamceller som kan användas för att ta itu med grundläggande och translationella frågor.
Introduction
Rörelse, andning, ämnesomsättning, kroppshållning och upprätthållande av kroppstemperatur beror alla på skelettmuskulaturen, och funktionsstörningar i skelettmuskulaturen kan därför orsaka försvagande patologier (dvs. myopatier, muskeldystrofier, etc.) 1. Med tanke på dess väsentliga funktioner och överflöd har skelettmuskulaturen uppmärksammats av forskningslaboratorier över hela världen som strävar efter att förstå de viktigaste aspekterna som stöder normal muskelfunktion och kan fungera som terapeutiska mål. Dessutom är skelettmuskulatur en allmänt använd modell för att studera regenerering och stamcellsfunktion, eftersom friska muskler kan reparera sig själva helt efter fullständig skada och degeneration, främst på grund av dess inneboende stamceller2; Dessa kallas också satellitceller och är lokaliserade under den basala laminan i periferin av muskelfibrerna3.
Kärncellerna i vuxen skelettmuskulatur är myofibrerna (långa syncytiala multinukleära celler) och satellitcellerna (stamceller med myogen potential som är vilande tills en skada aktiverar dem). De senare cellerna är de centrala cellerna för muskelregenerering, och denna process kan inte ske i deras frånvaro 4,5,6,7. I deras omedelbara mikromiljö finns det flera celltyper och molekylära faktorer som signalerar till dem. Denna nisch etableras gradvis under hela utvecklingen och fram till vuxen ålder8. Vuxna muskler innehåller flera celltyper (endotelceller, pericyter, makrofager, fibro-adipogenic progenitors-FAPs, regulatoriska T-celler, etc.) 9,10 och extracellulära matriskomponenter (lamininer, kollagener, fibronektin, fibrillliner, periostin, etc.) 11 som interagerar med varandra och med satellitcellerna i samband med hälsa, sjukdom och regenerering.
Att bevara denna komplexa nisch i experimentella miljöer är grundläggande men utmanande. Lika svårt är det att bibehålla eller återgå till vila, ett celltillstånd som är kritiskt för satellitceller9. Flera metoder har introducerats för att delvis ta itu med dessa utmaningar, var och en med sina för- och nackdelar (beskrivs i diskussionsavsnittet). Här presenteras en metod som delvis kan överbrygga dessa två hinder. Musklerna skördas först och bryts sedan ner mekaniskt och enzymatiskt innan den heterogena cellblandningen odlas. Under odlingens gång detekteras många celltyper i nischen, och satellitceller som har återgått till vila observeras. Som ett sista steg i protokollet presenteras de immunofluorescenssteg som gör det möjligt att detektera varje celltyp genom användning av universellt accepterade markörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök uppfyllde franska och EU:s djurregler vid Institut Mondor de Recherche Biomédicale (INSERM U955), särskilt direktivet 2010/63/UE. Djuren hölls i en kontrollerad och berikad miljö på djuranläggningarna med certifieringsnummer A94 028 379 och D94-028-028. De hanterades endast av auktoriserade forskare och djurskötare, och de inspekterades visuellt av djurhållningspersonal för tecken på obehag under deras livstid. De avlivades genom cervikal luxation före dissektion. Inga interventionsprocedurer utfördes under djurens livstid. Det var därför inte nödvändigt att få förfarandet godkänt av en etisk kommitté och det franska ministeriet för högre utbildning, forskning och innovation. Faktum är att det inte krävs något etiskt godkännande för avlivning och obduktion enligt direktiv 2010/63/EU. Resultaten som presenteras i detta manuskript är från vildtypslinjen C57BL/6NRj (se Materialtabell) och den transgena Tg:Pax7-nGFP-linjen 12 (uppfödd av vårt team). Protokollet tillämpades på han- och honmöss i åldern 8-12 veckor.
1. Förberedelse av reagens och utrustning för fördigestion
- Spraya dissektionsverktygen (rak och böjd sax, pincett, se materialtabellen) med 70 % etanol och torka dem med papper. Täck en korktallrik med aluminiumfolie och ha 10 cm petriskålar (en per djur) i närheten. Ha papper och 70% etanol inom räckhåll.
OBS: I slutet av dissektionen, skölj dissektionsverktygen med vatten, spraya dem sedan med 70 % etanol och torka dem med papper. - Ställ in ett roterande vattenbad på 37 °C och förbered digestionsblandningen (20 ml/djur) genom att kombinera DMEM med 1 % penicillin-streptomycin, 0,5 E/ml kollagenas, 3 E/ml dispase (se materialtabellen) och 0,2 % BSA i 50 ml rör.
- Låt rötningsblandningen passera genom ett 0,22 μm filter i en cellodlingshuva.
OBS: Det rekommenderas att förbereda digestionsblandningen färsk varje gång.
2. Beredning av reagens och utrustning efter uppslutning
- Efter matsmältningen kan blandningen frysas eller odlas. För frysning, förbered 10 % DMSO:90 % fetalt bovint serum (FBS), samt en uppsättning kryorör (1 ml cellsuspension per 2 ml kryorör). För odlingen, förbered odlingsmediet (DMEM kompletterat med 1 % penicillin-streptomycin, 4 ng/ml bFGF och 20 % FBS) och en uppsättning plattor med 8 brunnar. Plattorna måste beläggas innan cellerna pläteras (detaljer finns i steg 7.1).
- För färgningen, förbered 4 % paraformaldehyd (PFA) i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (0,15 ml/brunn i 8-hålsplattan) och blockerande lösning (5 % IgG-fritt bovint serumalbumin [BSA] i PBS; 0,15 ml/brunn i 8-hålsplattan).
VARNING: Andas inte in PFA-pulvret; Förbered och hantera den under en kemisk huv.
3. Dissektion
- Spraya det avlivade djuret med 70 % etanol. Gör ett horisontellt snitt (vänster sida av kroppen till höger sida) med en stor sax i nivå med buken och klipp runt midjan. Dra bort huden från bakbenen för att avslöja musklerna (Figur 1A).
- Placera djuret på den aluminiumfolietäckta korkplattan och nåla fast den motsatta frambenen och bakbenet. Ta snabbt bort alla bakbensmuskler (fram och bak) i en 10 cm petriskål placerad på is (Figur 1B,C). Var särskilt noga med att ta bort fettvävnaden från områdena runt quadriceps och de bakre musklerna. Fascia, nerver och senor kan också tas bort vid denna tidpunkt om detta inte äventyrar den totala tiden för dissektion.
OBS: En optimal dissektionstid för båda bakbenen bör vara cirka 15-20 min. Det rekommenderas att dissektionstiden inte överstiger 30 minuter. - Lägg till droppar DMEM till musklerna ibland för att hålla dem fuktiga, men inte för mycket, eftersom detta kommer att göra det svårt att hugga. Upprepa för det andra bakbenet. När alla muskler från ett djur är i petriskålen (Figur 1D), hacka dem fint med sax i 7-10 minuter för att få en slät homogenat (Figur 1E).
OBS: I detta protokoll används DMEM kompletterat med L-glutamin, pyruvat och 4,5 g/L D-glukos.
Figur 1: Förberedelse av muskler före odling. (A) Huden avlägsnas för att avslöja bakbensmusklerna, enligt beskrivningen i steg 3.1. (B,C) Alla bakbensmuskler skördas (B) runt och (C) mellan benen, enligt beskrivningen i steg 3.2. (D) De skördade musklerna placeras i en 10 cm petriskål på is med DMEM-droppar för att hålla dem fuktiga, enligt beskrivningen i steg 3.3. (E) Musklerna finhackas med sax tills en slät pasta erhålls med den konsistens som visas på denna bild. F) En bild av pelleten efter den slutliga centrifugeringen. Den blå pilen markerar pelleten, som ligger mot röret, under den streckade blå linjen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Matsmältning
OBS: I slutet av uppslutningen behövs en centrifug vid 4 °C, en hink med is, tre cellsilar (100 um, 70 um, 40 um) och tre 50 ml rör (per djur) för sektion 5.
- Bered och filtrera digestionsblandningen enligt beskrivningen i steg 1.2. Förvara blandningen på is.
- När alla muskler är hackade, placera homogenatet i ett 50 ml rör med 20 ml matsmältningsblandning. Linda in lockets kanter med flexibel film för att förhindra läckage och placera röret i ett 37 °C skakvattenbad med låg till medelhög hastighet (50 rpm).
- Efter 1 timme vid 37 °C, öppna locket och blanda genom att försiktigt pipettera sju gånger upp och ner med en 10 ml pipett för att få en homogen blandning. Applicera ny film runt locket och lägg tillbaka den i det skakande vattenbadet. Efter 1 timme tar du bort slangen och stänger av badet.
OBS: För odling, använd denna inkubationstid för att belägga plattorna enligt beskrivningen i steg 7.1 innan du går vidare till avsnitt 5.
5. Filtrering
- Fyll rötröret med kall DMEM (kompletterad med 1% penicillin-streptomycin) upp till 50 ml. Blanda genom att vända röret tre gånger. Förvara DMEM i en ishink för nästa steg.
- Placera en 100 μm cellsil på ett nytt 50 ml rör. För den smälta blandningen genom cellsilen in i det nya röret. Centrifugera vid 600 x g i 5 minuter vid 4 °C. Häll ut supernatanten i en behållare för flytande avfall.
- Återsuspendera pelleten i 1 ml kallt DMEM (kompletterat med 1 % penicillin-streptomycin). Fyll röret upp till 50 ml med samma DMEM. OBS: Om centrifugeringen hoppas över, nästa pellet blir svårare att identifiera och underhålla.
- Placera en 70 μm cellsil på ett nytt 50 ml rör. För den centrifugerade/omsuspenderade blandningen genom cellsilen in i det nya röret. Centrifugera vid 80 x g i 5 minuter vid 4 °C.
OBS: Detta steg är inte obligatoriskt men rekommenderas för att eliminera cellskräp. - Placera en 40 μm cellsil på ett nytt 50 ml rör. För supernatanten genom cellsilen in i det nya röret. Centrifugera vid 600 x g i 5 minuter vid 4 °C, häll supernatanten i en behållare för flytande avfall och återsuspendera pelleten i FBS under odlingskåpet. Pelleten är mycket liten i detta steg (Figur 1F).
OBS: Filtrering genom 40 μm-silen tar bort skräp, vilket skulle ge en icke-specifik signal vid senare färgning av kulturerna.
6. (Valfritt) Frysning
OBS: Avsnitt 6 är valfritt. Protokollet kan pausas efter filtrering, men detta kan minska cellöverlevnaden och odlingsframgången.
- Tillsätt DMSO för att få ett 10 % DMSO:90 % FBS-förhållande och överför till kryorör (1 ml återsuspenderad pellets per 2 ml kryorör).
- Placera kryoröret vid −80 °C i en polystyrenlåda över natten. Flytta till −150 °C nästa dag för långtidsförvaring.
OBS: Kortvarig förvaring vid −80 °C är också möjlig. - När odlingen påbörjas ska kryoröret snabbt tinas upp i ett 37 °C vattenbad tills cellsuspensionen har tinat. Blanda med 4 ml DMEM under odlingskåpan. Centrifugera i 600 x g i 5 minuter vid 4 °C. Pipettera ut supernatanten och fortsätt enligt beskrivningen i steg 7.2.
7. Odling
OBS: Frysta eller färska cellsuspensioner kan förväntas fylla 24-32 brunnar med tre till fyra 8-hålsplattor.
- Täck 8-hålsplattor med beläggningslösningen, som bör tinas vid 4 °C eller på is (stambeläggningslösning förvaras normalt vid −20 °C). Tillsätt 0,4 ml beläggningslösning i en brunn och pipettera den från brunn till brunn. Efter att beläggningslösningen har överförts genom alla brunnar kan den samlas upp och frysas om för framtida odlingar. Förvara de belagda plattorna vid 37 °C i 30 minuter innan cellerna pläteras.
- Tillsätt DMEM (kompletterat med 1 % penicillin-streptomycin) kompletterat med 4 ng/ml bFGF (se materialtabell) till FBS-cellsuspensionen för att erhålla ett 20 % FBS:80 % DMEM-förhållande.
OBS: Även om tillsatsen av bFGF kan vara fördelaktig i primära myoblastkulturer och vid satellitliknande cellproduktion i bulkkulturer, är dess tillsats valfri, eftersom dess utelämnande i bulkkulturer på ~7 dagar inte allvarligt äventyrar cellutbytet. - Platta 0,4 ml av suspensionen per brunn (från steg 7.2) i de belagda 8-hålsplattorna.
OBS: Beräkna 30 cm2 kultur per djur för frysta och färska beredningar. - Inkubera kulturerna vid 37 °C med 5 % CO2 i upp till 10 dagar, byt medium varje dag efter att kulturen börjar ändra till en gulaktig färg (vanligtvis 5-7 dagar).
OBS: För att kvantifiera celler i S-fasen av cellcykeln13, tillsätt 10 μM EdU 2 h före fixering. För att fånga den första S-fasen, tillsätt 10 μM EdU från pläteringen och fixera vid 40 timmars odling.
8. Fixering
OBS: Avsnitt 8-10 bör utföras i rumstemperatur om inget annat anges.
- Pipettera ut odlingsmediet och fixera cellerna med 4 % PFA (0,15 ml/brunn).
VARNING: Tillsätt PFA under en kemisk huv.
OBS: Om alla brunnar är fixerade samtidigt, inkubera med PFA i rumstemperatur i 10 min. Om brunnarna är fixerade vid olika tidpunkter, tillsätt PFA till brunnarna som ska fixeras och håll plattan i inkubatorn vid 37 °C i 5 minuter. - Pipettera ut PFA och tillsätt PBS i 10 s (0.15 ml/brunn). Pipettera ut PBS och tillsätt färsk PBS i 5 min (0.15 ml/brunn).
OBS: Om alla brunnar är fixerade samtidigt, inkubera med PBS vid rumstemperatur. Om brunnarna är fixerade vid olika tidpunkter, tillsätt PBS till de fasta brunnarna och håll plattan i inkubatorn vid 37 °C i 5 minuter. Tillsätt sedan 0,4 ml PBS och förvara plattan i inkubatorn i upp till 1 vecka.
9. Permeabilisering och blockering
- När du är redo att färga, pipettera ut PBS och permeabilisera med 0.5 % TritonX 100 i PBS (0.15 ml/brunn) i 8 min. Pipettera ur TritonX 100, skölj med PBS i 10 s (0.15 ml/brunn), pipettera ur PBS och tvätta med PBS i 5 minuter (0.15 ml/brunn).
- Blockera med 5 % IgG-fri BSA i PBS i 30-60 min (0,15 ml/brunn).
10. Färgning
- Pipettera ut BSA och tillsätt den primära antikroppsblandningen utspädd i PBS (0,15 ml/brunn) (se materialtabellen; spädningar: anti-CD31 1:100, anti-FOSB 1:200, anti-GFP 1:1 000, anti-KI67 1:1 000, anti-MyHC 1:400, anti-MYOD 1:200, anti-MYOG 1:150, anti-PAX7 1:100, anti-PDGFRa 1:50) för inkubation över natten vid 4 °C.
OBS: Efter antikroppsinkubationen, samla upp antikroppsblandningen, tillsätt natriumazid och förvara vid 4 °C eller −20 °C (enligt antikroppstillverkarens instruktioner) för framtida återanvändning. - Pipettera ut antikroppsblandningen, skölj med PBS i 10 s (0.15 ml/brunn), pipettera ur PBS och tvätta med PBS i 5 min (0.15 ml/brunn).
- Pipettera ut tvätt-PBS, tillsätt den sekundära antikroppsblandningen (get-anti-mus Alexa Fluor 488, get anti-kanin Alexa Fluor 555, get anti-rat Alexa Fluor 647, get anti-mus Alexa Fluor 555, get anti-kyckling Alexa Fluor 488, alla används vid spädningar på 1:500-1,000) och kärnmarkör (t.ex. DAPI) utspädd i PBS (0,15 ml/brunn) (se materialförteckning), och inkubera i 1 timme i rumstemperatur, skyddad från ljus.
- Pipettera ut den sekundära antikroppsblandningen, skölj med PBS i 10 s (0.15 ml/brunn), pipettera ur PBS, tvätta med PBS i 5 minuter (0.15 ml/brunn), pipettera ur PBS och montera.
OBS: Om 8-hålsplattor med avtagbara separatorer används, dra av separatorerna innan montering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll möjliggör odling av muskelceller samtidigt som satellitcellerna och de flesta celler bevaras från sin endogena nisch. Figur 2 sammanfattar de viktigaste stegen i protokollet, medan väsentliga delar av dissektion och matsmältning presenteras i figur 1. Dissektion av bakbensmuskulaturen rekommenderas (Figur 1A-C), eftersom denna muskelgrupp är välstuderad och delar ett utvecklingsursprung och molekylära hierarkier14. Vi rekommenderar att du förbereder alla blandningar under sterila förhållanden. Dessutom noterades lägre odlingskontaminering när digestionsblandningen passerade genom ett 0,22 μm filter under en cellodlingshuva.
Vid plätering av 1/30 av en bulkförberedelse på belagda 1 cm2 brunnsplattor är långsträckta celler synliga 3-4 dagar efter att odlingen har startat. Detta kan dock variera beroende på cellkoncentrationen, och långsträckta celler kan börja dyka upp senare, särskilt när man expanderar frysta bulkberedningar. Cirka 7 dagar senare bör mediet ha blivit gult, och vid denna tidpunkt krävs dagliga mediebyten. Dessutom, vid denna tidpunkt, måste brunnarna täckas med myotuber. Endotelcellerna utgör en mindre del av kulturen. Den viktigaste indikationen på en framgångsrik odling är rikligt med PAX7+-celler, som kan kräva fixering och färgning. En praktisk musmodell som kan användas när det är möjligt är Tg:Pax7-nGFP-linjen 12, som möjliggör visualisering av PAX7-positivitet i form av GFP-uttryck; Satellitcellerna kan därför lätt detekteras av rapportörens GFP. GFP kan observeras vid 20x förstoring på ett inverterat epifluorescensmikroskop, vilket möjliggör analys av odlingens framgång medan odlingen pågår. Detta gör det också möjligt att avbilda PAX7-GFP-celler i bulkkulturer. Odlingar får inte lämnas längre än 10 dagar. Därefter börjar reservcellerna minska i antal, och myotuberna kan lossna från plattan. Misslyckade odlingar, inklusive baserade på nya erfarenheter av odlingar från frysta celler, kan fortfarande generera en stor andel fibrer men mycket få PAX7-GFP-celler. Vid användning av möss utan fluorescerande markör för PAX7 är det nödvändigt att utföra färgning för att bedöma effekten av reservcellsgenerering.
Följande antikroppar har testats och fungerar väl med det färgningsprotokoll som presenteras i avsnitt 10 i protokollet: anti-PAX7 (en markör för satellitceller och aktiverade myoblaster 15; även en markör för reservceller som uppstår i denna kultur), anti-myosin (en markör för myotuber15), anti-CD31 (en markör för endotelceller16), anti-GFP (om rapportmöss används), anti-MYOD (en markör för myoblaster 15), anti-MYOG (en markör för differentiering av myocyter 15), anti-KI67 (en markör för prolifererande celler17) och anti-PDGFRα (en markör för FAP15). Figur 3 visar myogena celler och nischceller efter 7 dagar i odling. När det gäller Figur 3A-C odlades muskelmassa från vildtypsmöss, medan för Figur 3D-F odlades muskelmassa från den tidigare nämnda Tg:Pax7-nGFP-linjen. Dubbelfärgning med PAX7 och KI67 (Figur 3A) möjliggjorde markering av de reservceller som uppträdde efter 5 dagar i odling och hade muskelstamcellsegenskaper, såsom utträde ur cellcykeln (KI67-status) och en lokalisering som "satelliter" till de bildade myotuberna. Dubbelfärgning med MyHC och MYOG (Figur 3B,D,E) gjorde det möjligt att markera de celler som avancerade genom muskeldifferentiering och därmed gradvis uttryckte MYOG och sedan smälte samman för att bilda multinukleära MyHC+ myotubes. Färgning med CD31 eller PDGFRα gjorde det möjligt att markera nischceller (figur 3C), såsom endotelceller och FAP. Figur 3D,E visar framväxande reservceller markerade med god jordbrukssed. Samfärgning med GFP och MyHC gjorde det möjligt att utvärdera reservcellernas satellitcellposition (figur 3E), medan samfärgning med GFP och andra aktiverings-/differentieringsmarkörer gjorde det möjligt att utvärdera reservcellernas viloliknande natur (figur 3F).
Bild 2: En översikt över protokollstegen. (A–D) Sekventiella steg av (A) dissektion, (B) uppslutning, (C) filtrering och (D) odling. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Immunfärgning av cellpopulationerna. (A) Immunofluorescens av myogena (markerade med PAX7; gröna) och cykliska (markerade med KI67; röda) celler. Kärnorna är motfärgade med DAPI (blått). Närvaron av icke-cykliska myogena celler (KI67-PAX7+) visar att protokollet kan producera viloliknande celler från vildtypsmöss som är rikligt förekommande vid 7 dagars odling. (B) Immunofluorescens av myotuber (markerade med myosin tung kedja [MyHC]; gröna) och myocyter (markerade med MYOG; röda) efter 7 dagars odling av celler från vildtypsmöss. Kärnorna är motfärgade med DAPI (blått). (C) Immunofluorescens av myogena celler (markerade med PAX7; gröna), mesenkymala fibro-adipogena stamceller (markerade med PDGFRa; röda) och endotelceller (markerade med CD31; magenta) efter 7 dagars odling av celler från vildtypsmöss. Kärnorna är motfärgade med DAPI (blått). (D) Immunofluorescens av GFP+-celler (gröna) och myocyter (markerade med MYOG; magenta) efter 8 dagars odling av celler från Tg:Pax7-nGFP-möss, i vilka PAX7-uttryckande celler är märkta med kärn-GFP. (E) Immunofluorescens av GFP+-celler (gröna) och myotuber (markerade med MyHC; röda) efter 7 dagars odling av celler från Tg:Pax7-nGFP-möss. Observera att de satellitcellliknande cellerna uppträder i kulturen efter 7 dagar. (F) Kvantifiering av GFP+-cellandelen som samuttrycker markörer för satellitceller (PAX7), aktivering (FOSB), proliferation (KI67) eller myogen differentiering (MYOD, MYOG). Felstaplarna anger standardavvikelsen. Skalstreck: 100 um. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Funktionen hos vuxna skelettmuskler stöds av en fint orkestrerad uppsättning cellulära interaktioner och molekylära signaler. Här presenteras en metod som gör det möjligt att studera dessa parametrar i en ex vivo-miljö som liknar den fysiologiska mikromiljön.
Flera grupper har rapporterat in vitro-metoder för att odla myogena celler. Dessa metoder syftade till att isolera satellitceller för att studera deras myogena stamegenskaper. Två huvudsakliga metoder används för att isolera rena satellitceller, antingen från kulturer av isolerade fibrer från soleus- och/eller EDL-muskler18eller från FACS-isolerade satellitceller, från bulkmuskler, med hjälp av en panel av antikroppar för Pax7, CD34 och a7-integrin för positiv selektion och CD45, CD31 och Sca1 för negativ selektion 19,20,21. Andra har också använt mekaniska kranar för att isolera primära myoblaster från bulkkulturer på gelatinpläterade plattor på grund av deras ömtåliga vidhäftningsegenskaper jämfört med andra celler såsom FAP22,23. Även om dessa metoder är lämpliga för att studera aktiveringen av satellitceller eller för att expandera dem i odling, växer cellerna i en miljö som saknar de stödceller som vanligtvis bidrar till deras nisch. Dessutom kräver dessa tillvägagångssätt att de myogena stamfäderna hålls i mer än 2 veckor för att etablera vilande mononukleära reservceller med högt Pax7-uttryck18. Samodlingar av satellitceller och andra celltyper, såsom makrofager, har också rapporterats. Detta har gjort det möjligt att studera en specifik cells direkta bidrag till myogena egenskaper såsom proliferation, differentiering och fusion24. Flera encelliga RNA-seq-studier har detaljerat den cellulära sammansättningen av skelettmuskulaturen25,26. Eftersom våra odlingsförhållanden gynnar generering av myogena celler har vi observerat en mycket högre andel reservceller och en lägre andel stödjeceller i bulkkulturer jämfört med dessa in vivo-studier.
Tre kritiska steg har identifierats i den metod som beskrivs här som kan öka effektiviteten. För det första är snabb och effektiv hackning nödvändig för att säkerställa optimal muskeldissociation under 2 timmars matsmältning och därefter ett högre cellutbyte. För det andra är kontinuerlig rotation under matsmältningen mycket viktig för att säkerställa korrekt spridning av enzymerna genom vävnaden. Slutligen är skonsam mekanisk dissociation också viktigt för optimal vävnadsdissociation.
Det finns fyra huvudsakliga begränsningar i detta protokoll. För det första är det fortfarande ett ex vivo-system, vilket innebär att vissa fysiologiska och biofysiska signaler kan gå förlorade eller förändras. Detta inkluderar signalering till/från muskelfibrerna, eftersom fibrerna förloras innan plätering, och myotuberna återuppbyggs under odlingen. För det andra återstår det att se om de bildade myotuberna har embryonala eller vuxna egenskaper och om de representerar de olika fibertyperna i långsamma och snabba muskler. Som referens kan nämnas att odlingar av C2C12-muskelcellinjen och humana myoblaster har visat att myotuber i 2D-odling är mindre mogna än deras in vivo-motsvarigheter 27,28, medan primära musmyoblastkulturer verkar leda till myosintyper som är representativa för de som finns in vivo 29. För det tredje, med denna metod, förlorar cellerna sin in situ-position under vävnadsdissociation, och de nybildade myotuberna saknar neuromuskulära och myotendinösa korsningar; Resultat om rumsliga särdrag bör därför tolkas med försiktighet. För det fjärde har det presenterade protokollet optimerats för friska vuxna muskler, men anpassningar kan vara nödvändiga om utgångsmaterialet kommer från åldrade eller myopatiska muskler som uppvisar omfattande fibros, ökad adipogen avsättning eller äventyrad cellaktivering.
De flesta av dessa begränsningar är gemensamma för andra metoder för ex vivo-muskelstudier, men detta protokoll har flera fördelar jämfört med dem. Det är det enda protokollet som gör det möjligt att skörda ett stort antal vilande reservsatellitceller. Dessutom representerar det en billig och enkel metod som inte kräver de speciella odlingsförhållanden eller expertis som är förknippade med inducerade pluripotenta stamceller, embryonala stamceller, myosfärkultur eller organoidkultur. Dessutom är bulkodlingen inte beroende av den komplicerade infrastruktur och standardisering som är förknippad med odlingar av myogena celler i hydrogeler eller andra byggnadsställningar. Jämfört med odlingar av isolerade myofibrer, FACS-isolerade primära celler eller preplating-berikade primära celler, bevarar bulkkulturen fler cellpopulationer som finns i den fysiologiska muskelmiljön. Dessa celler passerar genom en relativt fysiologisk väg av aktivering och differentiering som drivs av odlingsmediets tillväxtfaktorer snarare än de extrema och ovanliga signalerna från ormgifterna som vanligtvis används för att studera muskelregenerering in vivo30,31. Slutligen är den presenterade cellkulturen fördelaktig jämfört med att använda C2C12-celler, som, som med alla cellinjer, har genetiska förändringar jämfört med endogena eller primära celler.
Ovanstående fördelar gör detta protokoll till ett kraftfullt verktyg för tillämpningar som cellamplifiering och generering av en vilande satellitcellpool, som är nödvändiga för att utveckla cellterapier eller till och med svara på grundläggande frågor om vila och cellulär/molekylär reglering. Dessutom kan protokollet användas för att modifiera molekylär signalering via läkemedel, siRNA-inriktning eller transfektion med vektorer (plasmid, virus) som inducerar överuttryck eller uttryck av dominerande negativa former av de intressanta faktorerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
För figur 2 användes mallar från Servier Medical Art (https://smart.servier.com/). FR-laboratoriet stöds av Association Française contre les Myopathies - AFM via TRANSLAMUSCLE (bidrag 19507 och 22946), Fondation pour la Recherche Médicale - FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), Agence Nationale pour la Recherche - ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) och La Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130). Ovanstående finansiärer hade ingen roll i utformningen, insamlingen, analysen, tolkningen eller rapporteringen av denna studie eller skrivandet av detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
| anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
| anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
| anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
| anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
| anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
| anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
| anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
| anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
| Bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
| BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
| Cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
| Cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
| Cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
| Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
| Culture plate | Sarstedt | 94.6140.802 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
| Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
| Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
| Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
| EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
| Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
| Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
| Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
| Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
| Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Forcina, L., Cosentino, M., Musarò, A. Mechanisms regulating muscle regeneration: Insights into the interrelated and time-dependent phases of tissue healing. Cells. 9 (5), 1297 (2020).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- McCarthy, J. J., et al. Effective fiber hypertrophy in satellite cell-depleted skeletal muscle. Development. 138 (17), 3657-3666 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Hicks, M. R., Pyle, A. D. The emergence of the stem cell niche. Trends in Cell Biology. 33 (22), 112-123 (2022).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Gama, J. F. G., et al. Role of regulatory T cells in skeletal muscle regeneration: A systematic review. Biomolecules. 12 (6), 817 (2022).
- Loreti, M., Sacco, A. The jam session between muscle stem cells and the extracellular matrix in the tissue microenvironment. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 16 (2022).
- Sambasivan, R., et al. Distinct regulatory cascades govern extraocular and pharyngeal arch muscle progenitor cell fates. Developmental Cell. 16 (6), 810-821 (2009).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Bismuth, K., Relaix, F. Genetic regulation of skeletal muscle development. Experimental Cell Research. 316 (18), 3081-3086 (2010).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: From the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Abou-Khalil, R., Le Grand, F., Chazaud, B. Human and murine skeletal muscle reserve cells. Stem Cell Niche. 1035, 165-177 (2013).
- Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2011).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Qu, Y., Edwards, K., Barrow, J. Isolation, culture, and use of primary murine myoblasts in small-molecule screens. STAR Protocols. 4 (2), 102149 (2023).
- Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: Background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2011).
- Saclier, M., Theret, M., Mounier, R., Chazaud, B. Effects of macrophage conditioned-medium on murine and human muscle cells: analysis of proliferation, differentiation, and fusion. Methods in Molecular Biology. 1556, 317-327 (2017).
- Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Molecular Cell. 74 (3), 609-621 (2019).
- Tabula Muris Consortium et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Brunetti, J., Koenig, S., Monnier, A., Frieden, M. Nanopattern surface improves cultured human myotube maturation. Skeletal Muscle. 11 (1), 12 (2021).
- Denes, L. T., et al. Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation. Skeletal Muscle. 9 (1), 17 (2019).
- LaFramboise, W. A., et al. Effect of muscle origin and phenotype on satellite cell muscle-specific gene expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (10), 1307-1318 (2003).
- Azhar, M., Wardhani, B. W. K., Renesteen, E. The regenerative potential of Pax3/Pax7 on skeletal muscle injury. Journal of Generic Engineering and Biotechnology. 20 (1), 143 (2022).
- Hardy, D., et al. Comparative study of injury models for studying muscle regeneration in mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
