Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Wenn sich injizierte Embryonen zu G0-Erwachsenen entwickeln, kreuzen Sie alle einzelnen Fliegen zu geeigneten Balancer-Beständen, um potenzielle F1 CRISPR-bearbeitete Linien zu erweitern und in der Lage zu sein, die Vererbung der genomischen Veränderung zu verfolgen. Dann kreuzen Sie zufällig ausgewählte F1-Einzelmännchen zu geeigneten Balancer-Weibchen, um Nachkommen zu gewinnen, wenn ein F1-Männchen positiv für die Mutation ist. Sobald das Kreuz genommen hat, übertragen Sie das F1-Männchen zum Screening in ein Rohr.
Um genomische DNA zu extrahieren, squish die Fliege mit einer Pipette Spitze mit Extraktionspuffer. Sobald das Gewebe abgebaut ist, werfen Sie die Flüssigkeit. Der Extraktionspuffer enthält Proteinase K, ein Enzym, das Proteine in der Probe verdaut und durch hohe Hitze inaktiviert wird.
Nun, da die DNA zugänglich ist, gehen Sie zum PCR-Screening. Verwenden Sie zum Beispiel Primer, die entwickelt wurden, um einen Bereich zu verstärken, der die neue Sequenz enthält. Nur in Gegenwart der Modifikation wird der zweite Primer binden und ein PCR-Produkt verstärkt werden. Im Beispiel werden wir sehen, wie Fliegen gezüchtet und durch PCR gescreent werden, um eine Transaktivierungssequenz einzufügen, die das erste Exon des zweiglosen Gens ersetzt.
- Wenn nos-Cas9-Embryonen, die zuvor sowohl mit dem Guide-RNA-Expressionsplasmid als auch mit dem Ersatzspender injiziert wurden, sich zu Erwachsenen entwickeln, kreuzen Sie G0-Fliegen einzeln, um die Fliegen von einer für das Ziel allel geeigneten Linie zu balancieren.
Wenn die F2-Larven schlüpfen, wählen Sie den F1-Vater aus jedem Kreuz. Extrahieren Sie die genomische DNA, indem Sie jede Fliege 10 bis 15 Sekunden lang mit einer Pipettespitze mit 50 Mikroliter Nupmschpuffer zücken, ohne den Puffer zu verteilen. Geben Sie dann den verbleibenden Puffer in das Rohr und mischen Sie ihn gut.
Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten. Nach der Inkubation legen Sie die Rohre in 95 Grad Celsius Hitzeblock für 1 bis 2 Minuten, um die Proteinase K zu inaktivieren. Nach dem Spinnen für 5 Minuten bei 10.000 mal g, lagern Sie die Vorbereitung bei 4 Grad Celsius für weitere PCR-Analysen.
Führen Sie dreistufige PCR-basierte Bildschirme mit Primern vorwärts 1 und rückwärts 1 auf Bildschirm für die Existenz des Einsteckens oder Austauschs. Führen Sie PCR mit Vorwärts 2 und reverse 2 Primer, um das Einfügen oder Ersetzen aus drei Prime-Bereich zu überprüfen. Führen Sie PCR mit Primern M13F und reverse 3, um Enden in HDR zu überprüfen.
- Halten Sie die Fliegenlinien mit der bestätigten End-out HDR und stellen Sie Balance-Bestände aus der F2-Generation. Out kreuzen Sie die Balancer fliegen wieder, um alle unbeabsichtigten Mutationen auf anderen Chromosomen zu entfernen.
