Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Når injiserte embryoer utvikler seg til G0 voksne, kryss alle individuelle fluer til egnede balanserlagre for å utvide potensielle F1 CRISPR-redigerte linjer og kunne spore arven til den genomiske modifikasjonen. Deretter krysser du tilfeldig utvalgte F1-enkelthanner til egnede balanserende kvinner for å kunne gjenopprette avkom hvis en F1-mann er positiv for mutasjonen. Når korset har tatt, overfør F1-hannen til et rør for screening.
For å trekke ut genomisk DNA, squish flyet med en pipettespiss som inneholder ekstraksjonsbuffer. Når vevet er brutt ned, kaste ut væsken. Ekstraksjonsbufferen inneholder proteinase K, et enzym som fordøyer proteiner i prøven og deaktiveres av høy varme.
Nå som DNA er tilgjengelig, fortsett til PCR-screening. Bruk for eksempel primere designet for å forsterke en region som inkluderer den nye sekvensen. Bare i nærvær av modifikasjonen vil den andre primeren binde og et PCR-produkt bli forsterket. I eksemplet vil vi se fluer bli avlet og screenet av PCR for innsetting av en transaktiveringssekvens som erstatter den første eksonen til det grenløse genet.
- Når nos-Cas9 embryoer tidligere injisert med både guide RNA uttrykk plasmid og erstatning donor utvikle seg til voksne, krysse G0 flyr individuelt til balansere flyr fra en linje som passer for målrettet allele. Bedøv F1 avkom fra hver G0 kryss på en karbondioksid pad og tilfeldig plukke 10 til 20 menn under et stereomikroskop. Individuelt krysse hver mann valgt til en balansere kvinne fra en linje egnet for den målrettede allele.
Når F2-larvene klekkes, velg F1-faren fra hvert kors. Trekk ut genomisk DNA ved å klemme hver flue i 10 til 15 sekunder med en pipettespiss som inneholder 50 mikroliter squishing buffer uten å dispensere bufferen. Deretter dispenserer du den gjenværende bufferen inn i røret og blander godt.
Inkuber ved 37 grader Celsius i 20 til 30 minutter. Etter inkubasjonen plasserer du rørene i 95 grader Celsius varmeblokk i 1 til 2 minutter for å inaktivere proteinase K. Etter å ha spinnet ned i 5 minutter ved 10.000 ganger g, lagre preparatet på 4 grader Celsius for videre PCR-analyse.
Utfør tretrinns PCR-baserte skjermer ved hjelp av primere fremover 1 og omvendt 1 til skjermen for eksistensen av innsetting eller utskifting. Utfør PCR ved hjelp av fremover 2 og reverser 2 primere for å bekrefte innsetting eller erstatning fra tre førsteklasses region. Utfør PCR ved hjelp av primere M13F og omvendt 3 for å sjekke endene i HDR.
- Hold flylinjene med den bekreftede ende-ut HDR og etablere balanse aksjer fra F2 generasjon. Ut krysse balanseren flyr igjen for å fjerne eventuelle utilsiktede mutasjoner på andre kromosomer.
