Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Cuando los embriones inyectados se convierten en adultos G0, cruza todas las moscas individuales a las poblaciones de equilibradores adecuadas para ampliar las líneas editadas potenciales de F1 CRISPR y ser capaz de rastrear la herencia de la modificación genómica.
Para extraer ADN genómico, aplastar la mosca con una punta de pipeta que contiene amortiguador de extracción. Una vez que el tejido se descompone, expulse el líquido.
Ahora que el ADN es accesible, proceda a la detección de PCR. Por ejemplo, utilice imprimaciones diseñadas para amplificar una región que incluya la nueva secuencia.
- Cuando los embriones nos-Cas9 previamente inyectados con el plásmido de expresión de ARN guía y el donante de reemplazo se convierten en adultos, cruza G0 vuela individualmente a las moscas balanceadoras de una línea apropiada para el alelo objetivo.
Cuando las larvas F2 eclosionen, elige al padre F1 de cada cruz. Extrae ADN genómico cortando cada mosca durante 10 a 15 segundos con una punta de pipeta que contiene 50 microlitros de amortiguador de calamar sin dispensar el tampón.
Incubar a 37 grados Celsius durante 20 a 30 minutos. Después de la incubación, colocar los tubos en bloque de calor de 95 grados Celsius durante 1 a 2 minutos para inactivar la proteinasa K. Después de girar hacia abajo durante 5 minutos a 10,000 veces g, almacenar la preparación a 4 grados Celsius para un mayor análisis de PCR.
Realice pantallas basadas en PCR de tres pasos utilizando imprimaciones hacia delante 1 y invierta 1 para detectar la existencia de la inserción o sustitución. Realice PCR con adelante 2 y revierta 2 imprimaciones para verificar la inserción o sustitución de tres regiones primos.
- Mantener las líneas de vuelo con el HDR final confirmado y establecer stocks de equilibrio de la generación F2. Fuera cruzar las moscas del equilibrador de nuevo para eliminar cualquier mutación involuntaria en otros cromosomas.
