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Processando pernas de insetos para microscopia de fluorescência

 
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Processando pernas de insetos para microscopia de fluorescência: um método para preservar estruturas neuromusculares para imagem

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- Para começar, submerse insetos anestesiados em solução de 70% de etanol para reduzir a hidroofobosidade da cutícula. Em seguida, lave e permeabilize o tecido com soro fisiológico tamponado com fosfato contendo um detergente por pelo menos 30 minutos para permitir a penetração tecidual durante a fixação.

Em seguida, remova a cabeça e o abdômen do tórax. Use fórceps para aplicar pressão suave na junção coxa-tórax, e desprender a perna. Coloque cuidadosamente as pernas em solução de paraformaldeído gelado de 4% durante a noite para permitir que ele penetre no tecido. Paraformaldeído fixa tecidos por proteínas transversais.

Em seguida, remova a solução de fixação e lave o tecido várias vezes com soro fisiológico tamponado com fosfato contendo detergente. Antes de montar, coloque as pernas em tampão de montagem puro ou ligeiramente diluído por pelo menos um dia para fornecer tempo suficiente para o tampão entrar no tecido.

Por fim, monte as pernas em uma gota de meio de montagem. Use um espaçador entre o deslizamento do microscópio e a mancha de cobertura para evitar danos à amostra e fixe a montagem com esmalte.

No exemplo a seguir, veremos a dissecção, fixação e montagem de pernas melanogaster Drosophila.

- Comece preenchendo o número adequado de poços em uma placa multiwell de vidro com 70% de etanol. Use uma escova para adicionar 15 a 20 moscas anestesiadas com dióxido de carbono de qualquer idade ou sexo a cada poço, e gentilmente dab as moscas no etanol até que estejam totalmente submersas.

Depois de não mais do que um minuto, enxágüe as moscas três vezes com solução de detergente surfactante não ônico de 0,3% em soro fisiológico tamponado por pelo menos 10 minutos por lavagem. Após a última lavagem, use fórceps para remover a cabeça e o abdômen de cada mosca sem danificar o segmento torácico ou as pernas, e use a ponta de um par de fórceps finos para suavemente, mas aplique pressão na junção coxa-toráax para desacoplizar uma das pernas.

Coloque as pernas em um poço de uma nova placa multiwell, contendo 4% de paraformaldeído no gelo, para uma incubação durante a noite a 4 graus Celsius.

- É importante empurrar as pernas suavemente para dentro do tampão de fixação sem deixá-las flutuar para obter pernas bem fixas.

- No dia seguinte, lave as pernas cinco vezes em solução fresca de detergente surfactante não ônico de 0,3% por 20 minutos por lavagem. Após a última lavagem, substitua o detergente por meio de montagem e mantenha as pernas no meio de montagem por pelo menos 24 horas.

No dia seguinte, adicione aproximadamente 20 microlitros de 70% de glicerol ao lado da extremidade revestida do slide do microscópio de vidro e cubra o glicerol com um deslizamento de cobertura de 22 por 22 milímetros. Em seguida, adicione em cerca de 10 microliter linha de montagem média à direita do deslizamento de tampas e aplique uma segunda linha de 30 microliter de meio de montagem à direita da linha de 10 microliter.

Usando fórceps finos, transfira uma perna da placa multiwell em uma gota de média para a faixa de 10 microliter de meio de montagem em uma orientação externa para cima ou para baixo. Repita até que seis a oito pernas tenham sido montadas e alinhadas, e coloque uma segunda mancha sobre as pernas de tal forma que o segundo deslizamento de cobertura repouse ligeiramente na primeira mancha de cobertura.

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