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Procesamiento de patas de insectos para microscopía de fluorescencia

 
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Procesamiento de patas de insectos para microscopía de fluorescencia: un método para preservar estructuras neuromusculares para imágenes

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- Para empezar, sumerja insectos anestesiados en solución de etanol al 70% para reducir la hidrofobicidad de la cutícula.

A continuación, retire la cabeza y el abdomen del tórax. Utilice fórceps para aplicar presión suave a la unión coxa-tórax y desaparque la pierna. Coloque cuidadosamente las piernas en solución de paraformaldehído helada al 4% durante la noche para permitirle penetrar en el tejido.

A continuación, retire la solución de fijación y lave el tejido varias veces con solución salina tamponada de fosfato que contenga detergente. Antes de montar, coloque las patas en búfer de montaje puro o ligeramente diluido durante al menos un día para proporcionar suficiente tiempo para que el tampón entre en el tejido.

Por último, monte las patas en una gota de medio de montaje. Utilice un espaciador entre el portaobjetos del microscopio y la cubierta para evitar que la muestra dañe, y asegure el soporte con esmalte de uñas.

En el siguiente ejemplo, veremos la disección, fijación y montaje de las patas de Drosophila melanogaster.

- Comience por llenar el número adecuado de pozos en una placa multiwell de vidrio con 70% de etanol. Utilice un cepillo para agregar de 15 a 20 moscas anestesiadas de dióxido de carbono de cualquier edad o sexo a cada pozo, y coloque suavemente las moscas en el etanol hasta que estén completamente sumergidas.

Después de no más de un minuto, Enjuague las moscas tres veces con solución de detergente tensioactivo no iónico al 0,3% en solución salina amortiguada por fosfato durante al menos 10 minutos por lavado. Después del último lavado, utilice fórceps para extraer la cabeza y el abdomen de cada mosca sin dañar el segmento torácico o las piernas, y utilice la punta de un par de fórceps finos para aplicar presión suave pero firmemente a la unión coxa-tórax para separar una pierna del segmento torácico.

Coloque las patas en un pozo de una nueva placa multiwell, que contiene un paraformaldehído recién preparado en hielo, para una incubación nocturna a 4 grados centígrados.

- Es importante empujar las piernas suavemente en el búfer de fijación sin dejar que floten para obtener piernas bien fijas.

- Al día siguiente, lave las piernas cinco veces en solución de detergente tensioactivo fresco 0.3% no iónico durante 20 minutos por lavado. Después del último lavado, reemplace el detergente con el medio de montaje y mantenga las piernas en el medio de montaje durante al menos 24 horas.

Al día siguiente, añadir aproximadamente 20 microlitros de 70% de glicerol junto al extremo recubierto de la diapositiva del microscopio de vidrio y cubrir el glicerol con un tubo de cubierta de 22 por 22 milímetros.

Usando fórceps finos, transfiera una pierna de la placa multiwell en una gota de medio a la tira de 10 microlitros de medio de montaje en un lado externo hacia arriba o hacia abajo orientación.

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