Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Til å begynne med, senk bedøvede insekter i 70% etanoloppløsning for å redusere kutikalitetens hydrofobi. Deretter vasker og permeabiliserer vevet med fosfatbufret saltvann som inneholder et vaskemiddel i minst 30 minutter for å tillate vevsinntrengning under fiksering.
Deretter fjerner du hodet og magen fra thoraxen. Bruk tang til å påføre forsiktig trykk på coxa-thorax-krysset, og løsne benet. Plasser bena forsiktig i iskald 4% paraformaldehydoppløsning over natten for å la den trenge inn i vevet. Paraformaldehyd fikser vev ved krysskobling av proteiner.
Fjern deretter fikseringsløsningen og vask vevet flere ganger med fosfatbufret saltvann som inneholder vaskemiddel. Før montering, legg bena i ren eller litt fortynnet monteringsbuffer i minst en dag for å gi nok tid til at bufferen kan komme inn i vevet.
Til slutt monterer du bena i en dråpe monteringsmedium. Bruk en avstandsstykke mellom mikroskopet og dekslene for å forhindre at prøven skades, og fest braketten med neglelakk.
I det følgende eksemplet vil vi se avhandlingen, fikseringen og monteringen av Drosophila melanogasterben.
- Begynn med å fylle riktig antall brønner i en multiwellplate i glass med 70 % etanol. Bruk en børste til å tilsette 15 til 20 bedøvede fluer i alle aldre eller kjønn til hver brønn, og forsiktig dab fluene inn i etanolen til de er helt nedsenket.
Etter ikke mer enn ett minutt, skyll fluene tre ganger med 0,3% ikke-ionisk overflateaktivt vaskemiddeloppløsning i fosfatbufret saltvann i minst 10 minutter per vask. Etter siste vask, bruk tang til å fjerne hodet og magen på hver flue uten å skade thoracic segmentet eller bena, og bruk spissen av et par fine tang for å forsiktig, men fast påføre trykk til coxa-thorax-krysset for å løsne ett ben fra thoracic-segmentet.
Legg bena i en brønn av en ny multiwell plate, som inneholder nylaget 4% paraformaldehyd på is, for en overnatting inkubasjon ved 4 grader Celsius.
- Det er viktig å skyve bena forsiktig inn i fikseringsbufferen uten å la dem flyte for å oppnå godt faste ben.
- Neste dag, vask bena fem ganger i frisk 0,3% ikke-ionisk overflateaktivt vaskemiddeloppløsning i 20 minutter per vask. Etter siste vask, bytt vaskemiddelet med monteringsmedium og hold bena i monteringsmediet i minst 24 timer.
Neste dag legger du til ca. 20 mikroliter med 70 % glyserol ved siden av den belagte enden av glassmikroskopet og dekker glyserolen med en 22 x 22 millimeter deksleslip. Deretter legger du til omtrent 10 mikroliterlinjen med monteringsmedium til høyre for dekslene og påfører en ekstra 30-mikroliterlinje med monteringsmedium til høyre for 10-mikroliterlinjen.
Bruk fine tang, overfør ett ben fra multiwellplaten i en dråpe middels til 10-mikroliterstripen av monteringsmedium i en ekstern side opp eller ned orientering. Gjenta til seks til åtte ben er montert og justert, og legg en andre deksle over bena slik at den andre dekslen hviler litt på de første dekslene. Bruk deretter neglelakk i hvert hjørne av dekslene for å feste dem på plass.
