Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Başlamak için, genç yetişkin solucanları bir slayttaki taze bir agarose ped üzerine aktarın. Sonra solucanları felç etmek için birkaç damla 12 milimolar levamisole çözeltisi ekleyin. Solucanları bir kapakla örtün ve birkaç dakika bekleyin. Slaytı dönen bir disk konfokal mikroskobun altına yerleştirin ve solucanın en dış yüzeyine odaklanın.
Yetişkin bir solucanın epidermisi, hücre füzyon olaylarından kaynaklanan çok çekirdekli senkripten oluşan ince tek katmanlı bir yapıdır. Epidermisin apikal yüzeyi esnek bir kollajen kütikül salgılar, bazal yüzey ise bazal lamina adı verilen ince bir hücre dışı matris tabakası ile kaplıdır.
Daha sonra, epidermisin apikal yüzeyini bir lazerle yaralayın. Hasarlı hücrelerden sitoplazma dışarı sızabilir ve yara yerinde bir kabarcık olarak görünebilir.
Lazer ışınlama, iç dokulara zarar vermeden oksikül ve epidermal hücrelerin lokalize bozulmasına neden olduğu için iğne yaralama gibi diğer tekniklere göre avantajlıdır. Örnek protokolde C. eleganlarda lazerle yaralama işlemini göreceğiz.
- Nematodları hassas bir şekilde yaralamak için, bu protokol dönen disk konfokal mikroskobuna bağlı bir femtosaniye lazer kullanır.
- Bir agar ped üzerinde 10 genç yetişkin toplayarak başlayın. 12 milimolar levamisole çözeltisinin iki mikrolitre damlasında onları felç edin. Sonra bir kapak kayması ile örtün ve felç olurken birkaç dakika bekleyin.
- Bir hayvanın tamamen felç olması esastır. 12 milimoler levamisol yara yanıtını etkilemeyecektir. Ancak, başka hareketsizleştirme yöntemleri de kullanılabilir.
- Femtosaniye lazer gücünün amaçtan önce ölçüldüğü gibi 140 miliwatt'a ayarlı olduğundan ve lazer tekrarlama oranının 80 megahertz'de olduğundan emin olun. Şimdi, solucanları dönen bir disk konfokal mikroskobun altında bulun. Yüksek sayısal diyafram açıklığına sahip 100x hedefi kullanarak, hedefin lateral ön veya posterior senktiyal epidermisine odaklanın.
Epidermal hücrenin apikal yüzeyine odaklanarak, lazeri 20 milisaniye ile ayrılmış iki 200 milisaniyeye kadar parlatın. Bu epidermisi yaralamak için yeterli olmalıdır. Bir dakika bekleyin ve köpürme olarak görünecek sitoplazmanın lokal bozulmasını gözlemleyin. Floresan bir işaretleyici varsa, lokalize ağartma görülebilir.
