Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Transfira um peixe anestesizado de tricêrina em uma esponja molhada com o lado dorsal voltado para cima. Coloque a esponja carregando o peixe sob um microscópio. Posicione uma agulha de microinjeção em um ângulo de 45 graus do eixo corporal próximo ao músculo dorsal.
Em seguida, localize o local em frente à barbatana dorsal que não está coberta com escamas onde você pode inserir a agulha sem aplicar grande força. Em seguida, insira suavemente a agulha e injete lentamente o composto de juros junto com um marcador como o vermelho fenol no músculo.
Se o composto de interesse contiver material genético, eletroporar as células colocando eletrodos em ambos os lados do local de injeção e administrando a corrente. A corrente torna as células musculares permeáveis e capazes de tomar eficientemente o material genético. Após o procedimento, transfira imediatamente o peixe para um tanque de recuperação. No protocolo seguinte, realizaremos uma injeção intramuscular em um peixe-zebra adulto para fornecer uma vacina de DNA contra a micoscoiria.
Para manter o peixe em posição fixa durante a injeção, use um pedaço de esponja com um sulco cortado no meio como preenchimento. Mergulhe a esponja completamente na água do sistema e coloque-a em uma placa de Petri. Usando uma colher de plástico, transfira um peixe-zebra anestesiado para a esponja molhada com o lado ventral do peixe para baixo na ranhura. Sob o microscópio, coloque a agulha em um ângulo de 45 graus perto do músculo dorsal do zebrafish. Em seguida, encontre o pequeno ponto sem escamas na frente da barbatana dorsal e empurre a agulha para dentro do músculo.
Se alguma resistência for sentida, tente um local adjacente. Use um interruptor de pé para injetar gradualmente a solução plasmida no músculo. Sob o microscópio, o vermelho fenol deve ser visível à medida que entra no tecido muscular.
Eletroporar o peixe imediatamente após a injeção colocando os eletrodos tipo pinça em cada lado do local da injeção. Pressione o botão Iniciar no eletroporador e dê-lhe seis pulsos de 40 volts, 50 milissegundos. Em seguida, transfira suavemente o peixe para um tanque de recuperação. Finalmente, depois de anestesiar o peixe de acordo com o protocolo de texto, use uma luz UV para ver a expressão EGFP perto do local da injeção.
