A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Chapters
- 00:05Title
- 00:43Synthesis of NNS Sub-libraries for Each Amino Acid Position by Two-step PCR Site-directed Mutagenesis
- 01:53Cloning of NNS Sub-libraries into Selection Vectors
- 03:47Selection of the TEM-1 Whole-Protein Saturation Mutagenesis Library for Antibiotic Resistance
- 05:51High Throughput Sequencing to Determine Fitness Effects of Mutations
- 08:44Results: High Throughput Sequencing from Whole-Protein Saturation Mutagenesis
- 10:16Conclusion
Vi presenterer en protokoll for funksjonell vurdering av omfattende single-site metning mutagenese biblioteker av proteiner utnytte high-throughput sekvensering. Viktigere, bruker denne tilnærmingen ortogonale primerpar å multiplekse bibliotek konstruksjon og sekvensering. Representative resultater ved hjelp av TEM-1 β-laktamase valgt på en klinisk relevant dosering av ampicillin er gitt.
