تشيب-Seq: التنميط Epigenome الخلية-نوع معين

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الوراثة اللاجينية مثل كم يتم تنظيم التعديلات اللونية بطريقة محددة من نوع الخلية مع الجينوم. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا يمكن أن نعزل الكروماتين من الخلايا المستهدفة ومن ثم اتباع المصب الغجري النموذجي. حتى هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى في الخلايا العصبية تقليم محددة، lysinc 4، opisoncilly.

ويمكن أيضا أن تطبق على تعديل الحجر الهوتي الأخرى، وأنواع الخلايا الأخرى، ومن ثم الكائنات الحية نموذج آخر. (سيثبت الإجراء أن (ماري ميتو، تقني من مختبري للبدء ، استخدم مقص ربيعي جيد لتشريح الأنسجة ذات الاهتمام إلى قطع صغيرة.

إضافة شظايا الأنسجة إلى وعاء نظيف مملوء بالنيتروجين السائل. ثم، نقل شظايا الأنسجة إلى أنابيب ملليلتر اثنين مليئة النيتروجين السائل. تخزين الأنابيب في ناقص 80 درجة مئوية لمدة خمس دقائق مع غطاء مفتوحة لتبخر النيتروجين السائل.

ضع الأنابيب التي تحتوي على عينات الأنسجة على رف الجليد المعدني المبرد. ثم ضع رصاصة معدنية في أنبوب 1.5 ملليلتر وقم بتبريدها بالنيتروجين السائل. ضع الرصاصة المعدنية المبردة على أحد الأنابيب العينة.

أغلق الغطاء واضبط الأنبوب في حامل الأنبوب لمطحنة التبريد. على الفور، تراجع حامل أنبوب تجميعها في النيتروجين السائل لمدة دقيقة واحدة. أدخل حامل الأنبوب المجمد في الكاسيت الخارجي للمطحنة المبردة.

و هزها بقوة لمدة 30 ثانية، 60 مرة. بعد ذلك، تفكيك طاحونة خفي، إزالة الرصاصة المعدنية. ووضع الأنبوب في مبرد عينة مبردة مسبقًا.

تخزين برودة في درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم، إضافة 900 ميكرولترات من 1٪ الفورمالديهايد إلى أنبوب وماصة لخلط. نقل التعليق إلى أنبوب ملليلتر جديد مع 900 ميكرولترات من 1٪ الفورمالديهايد.

بعد ذلك، قم بإصلاح التعليق لمدة 10 دقائق مع دوران لطيف عند درجة حرارة 23 درجة مئوية. لوقف التفاعل التثبيت، إضافة 100 ميكرولترات من 2.5 جليسين المولر إلى الأنبوب. وطاردة مركزية في 3000 مرة الجاذبية لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.

بعد هذا، تجاهل السوبر سوبرنانت. إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني إلى أنبوب ودوامة لخلط. جهاز طرد مركزي في 3،000 مرة الجاذبية لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.

كرر هذه الخطوة غسل، مرتين أكثر. المقبل، إضافة 500 ميكرولترات من تحلل العازلة واحد إلى بيليه وماصة لخلط. جهاز طرد مركزي الأنبوب لمدة خمس دقائق في 3،000 مرة الجاذبية في أربع درجات مئوية والتخلص من فائقة.

إضافة ملليلتر واحد من العازلة تحلل اثنين إلى بيليه ودوامة لخلط. ثم، الطرد المركزي تعليق لمدة خمس دقائق في 3،000 مرة الجاذبية في أربع درجات مئوية والتخلص من عظمى. بعد هذا، إضافة 800 ميكرولترات من عازلة فحص المناعة الراديوية مع كوكتيل مثبطات البروتياز إلى بيليه وماصة لخلط.

الطرد المركزي تعليق لمدة خمس دقائق في 3،000 مرة الجاذبية في أربع درجات مئوية والتخلص من فائقة. المقبل، إضافة 500 ميكرولترات من العازلة RIPA مع كوكتيل مثبطات البروتياز إلى بيليه. ثم، الطرد المركزي تعليق لمدة خمس دقائق في 3،000 مرة الجاذبية في أربع درجات مئوية والتخلص من عظمى.

إضافة ملليلتر واحد من العازلة RIPA مع كوكتيل مثبطات البروتياز. مباشرة بعد إضافة RIPA العازلة مع كوكتيل مثبطات البروتياز، نقل lysate إلى أنبوب sonicator. ووضع الأنبوب على أوفوق الصوتيات.

باستخدام الإعدادات الموضحة في بروتوكول النص، اجز الكروماتين. ثم, نقل العينة إلى 1.5 ملليلتر بروتين انخفاض ربط أنبوب. و جهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق في 20،000 مرة الجاذبية عند أربع درجات مئوية.

جمع افرا من العينة ونقلها إلى بروتين جديد انخفاض ملزمة أنبوب. في هذا البروتوكول، تم إدخال تسلسل صفاء المناعة جنبا إلى جنب مع الكروماتين وبرهن. أثناء الإجراء، تم اختبار نوعية الحمض النووي في خطوات متعددة.

مباشرة بعد سونيكيشن، تم عزل الحمض النووي مُخَصَّص واختُبِضَ مع آلة الكهرباء الدقيقة الفُذرية. بعد استخدام الأجسام المضادة لـ FLAG والأجسام المضادة H3K3me3 لإجراء تنقية التقارب تم فحص جودة الحمض النووي مرة أخرى. تم تأكيد خصوصية تنقية الحمض النووي المناعي على H2B-FLAG مع عينات التحكم السلبية.

حيث تم الكشف عن كميات لا تذكر من الحمض النووي. وفي البروتوكول الإضافي، تم التحقق من جودة مكتبة التسلسل. وقد تم إثبات ChIP الناجحة و T-ChIP من خلال تحليل الإثراء باستخدام الأقواس التي تستهدف المنطقة المروجة لجين GAPDH.

تم الحصول على إعادة توزيع تمثيلية على طول ثلاث جينات الخلايا العصبية. ولوحظ إثراء يقرأ في نهايات خمسة رئيس الجينات من قبل الخلايا العصبية T-ChIP تسعى على الدماغ كله T-ChIP البحث. بعد stabiliment، هذه التقنية يمهد الطريق للباحثين في مجال اللاجينية لاستكشاف نوع الخلية تعديل حجر الهستون محددة عامة على نطاق واسع في الخلايا العصبية في الفئران.

لا تنس أن العمل مع الفورمالديهايد يمكن أن تكون خطرة للغاية واتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء الملابس المطاطية والنظارات ينبغي دائما أن تتخذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.