Biology
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Spermiengewinnung differenzielle Qualität mit Dichte-Gradienten-Zentrifugierung
Chapters
Summary November 29th, 2018
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In diesem Beitrag wollen wir die Leistung der Dichte-Gradienten-Zentrifugierung-Technik und deren Anwendung in Sperma-Physiologie-Forschung beschreiben.
Transcript
Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Spermienphysiologie zu beantworten, wie die chemischen Determinen der Spermienqualität. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, große Mengen von Proben nach Qualität zu trennen, sowie Anpassungsfähigkeit im Vergleich zu alternativen Methoden. Obwohl diese Methode Einen Einblick in die Unterschiede in der Spermienqualität bieten kann, kann sie auch auf andere Proben wie gemischte Zelltypen oder subzelluläre Komponenten mit unterschiedlicher Dichte angewendet werden.
Zu Beginn zwei 3 Milliliter Percoll-Verdünnungen in zwei separaten Röhren machen. In einem sauberen Reagenzglas 1 Milliliter Samenprobe mit 2 Milliliter PBS verdünnen. Pfeifen Sie es sanft, um die Lösung zu mischen.
Fügen Sie 3 Milliliter der unteren Dichte Percoll sollution zu einem sterilen konischen Rohr. Dann, sorgfältig Pipette 3 Milliliter der höheren Dichte Percoll Lösung unter der unteren Dichte Percoll-Lösung. Beim Kippen des konischen Rohres in einem 45-Grad-Winkel, Pipette 3 Milliliter der verdünnten Samenprobe auf dem Percoll-Dichtegradienten.
Nach der Vorbereitung eines Rohrohres zentrieren Sie beide Rohre bei 1500 Gs für 20 Minuten. Stellen Sie sicher, dass sich nach der Zentrifugation drei verschiedene Samenschichten in der Wanne gebildet haben. Mit einer Pipette sammeln Sie die drei Schichten Sperma, beginnend mit der oberen Schicht, gefolgt von der mittleren Schicht, und endet mit dem harten Pellet an der Unterseite des Rohres.
Jede der Schichten in ein steriles Mikrozentrifugenrohr übertragen. Verdünnen Sie jede der Samenproben mit 1,5 Milliliter PBS und zentrifugieren Sie die Proben bei 1500 Gs für zehn Minuten. Schließlich den Überstand abgießen und die Pellets mit Motilitätspuffer rekonstituieren.
In diesem Protokoll wurde die Percoll-Dichtegradientenzentrifugationstechnik (PDGC) verwendet, um eine Samenprobe in drei verschiedene Schichten zu unterteilen. Sperma trennt sich in eine hochwertige Schicht unterhalb der Lösung mit höherer Dichte, eine schicht mittlerer Und-Dichte zwischen den Lösungen mit höherer und niedrigerer Dichte und eine Schicht niedriger Qualität über der Lösung mit niedrigerer Dichte. Diese Unterschiede in der Spermienqualität werden durch Unterschiede in der Lebensfähigkeit, Mobilität und Durchlässigkeit belegt.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Proben auf Raumtemperatur gebracht werden müssen. Der Erfolg von PDGC ist auf eine sorgfältige Vorbereitung des Gradienten sowie eine sorgfältige Erfassung der isolierten Schichten angewiesen. Nach seiner Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für unsere Forschung auf dem Gebiet der Spermienperdiomik, um Bio-Marker der Fruchtbarkeit bei Vogelarten zu erforschen.
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