Generatie van Organoids van muis Extrahepatic galwegen

Dit murine extrahepatische galkanaal organoïde systeem kan de beperkte toegang tot preklinische cholangiopathieën modellen en de beperkingen van pluripotente stamcel en lever-afgeleide cholangiocyte organoïde modellen aan te pakken. Ons model is specificeerbaar, reductionistisch, reproduceerbaar en tijd- en kostenefficiënt. Het zal van bijzonder nut zijn voor laboratoria die geen toegang hebben tot menselijke weefsels.

Onze techniek maakt het mogelijk om een bijna onbeperkt aantal extrahepatische galbuizencholangiocyten te kweken om weefselregeneratie en cel-naar-cel interacties te bestuderen. Het aantonen van de procedure zal Junya Shiota zijn, een post-doc uit mijn laboratorium. Voor intrahepatische galkanaalisolatie plaatst u de volwassen muis in een supinepositie en opent u de buikholte langs de middellijn.

Trek de lever in om op het middenrif te rusten en gebruik een hemostat om voorzichtig de proximale twaalfvingerige darm te trekken om het gemeenschappelijke galkanaal direct onder het levergevest te onthullen. Gebruik een scalpel om de extrahepatische galbuis te scheiden van de omliggende weefsels. Houd het proximale uiteinde van de gemeenschappelijke galbuis met tangen, ontleden het kanaal distaal net boven het kruispunt met de twaalfvingerige darm voordat ontleden het proximale uiteinde van het kanaal uit de lever.

Plaats onmiddellijk de geïsoleerde extrahepatische galbuis in een glasplaat met koude wasbuffer op ijs, maak vervolgens de galbuis van het omliggende weefsel schoon en hak in 0,5 millimeter secties. Wanneer al het weefsel is gehakt, breng de secties in een buis met 500 microliters van dissociatie buffer voor een 20-minuten incubatie bij 37 graden Celsius. Neutraliseer aan het einde van de dissociatie de buffer met 500 microliters ijskoud celkweekmedium en trituraat de weefselsuspensie 20 keer via een naald van 18 meter en vervolgens 20 keer door een naald van 20 meter.

Vervolgens filter de resulterende cel suspensie door een 70-micrometer cel zeef in een 50-milliliter buis. Om een galorganoïde cultuur vast te stellen, verzamel de cellen door centrifugatie en verwijder zorgvuldig de supernatant. Resuspend de pellet in een milliliter ijskoude, steriele PBS en breng de cellen naar een 1,5-milliliter buis voor een tweede centrifugatie.

Resuspend de gewassen pellet in 120 microliter van vloeibaar, ijskoude kelder matrix en plaat 40 microliter van cellen in het midden van elk van de drie putten van een 37 graden Celsius opgewarmde, 24-well plaat, dan plaats de plaat in een 37 graden Celsius weefsel cultuur incubator voor ongeveer 15 minuten. Wanneer de kelder matrix is gestold, voeg 600 microliter van 37 graden Celsius zaaien medium aan elke goed voor de terugkeer van de plaat naar de incubator. Na drie dagen en om de drie dagen daarna, vervang het zaaimedium door 600 microliters van vers organoïde cultuurmedium, waarbij de organoïde groei regelmatig wordt gecontroleerd met een omgekeerde microscoop.

Om de extrahepatische galkanaalculturen door te geven, pipette de organoïden in elke put met 400 microliter ijskoude PBS 10 keer per goed alvorens de putinhoud over te brengen naar individuele 1,5-milliliter buizen. Passage elk mengsel door een 25-gauge naald vier keer om de organoïden te scheiden en het verzamelen van de cellen door middel van centrifugatie. Dan resuspend de cellen in keldermatrix bij de aangewezen verhouding voor het opnieuw beplating.

Voor langdurige extrahepatische galkanaalorganoïde opslag, was elke put van organoïden met kamertemperatuur PBS zonder verstoring van de kelder matrix druppels en voeg 500 microliters van ijskoud freezing medium aan elke put. Voorzichtig resuspend de organoïden en breng het mengsel in individuele cryogene flesjes, dan plaats de flesjes op min 80 graden Celsius gedurende 48 uur voor de overdracht van de organoïden naar een stikstoftank voor langdurige opslag in een dampfase. Om de organoïden voor te bereiden op paraffine inbedding, vervang het medium met 500 microliters van vier graden Celsius PBS en breng de suspensie van elke put in individuele 1,5-milliliter buizen met vloeibaar kelder matrix.

Verzamel de organoïden door centrifugatie en gebruik een aangepaste P1000 pipettip om de supernatants zorgvuldig te verwijderen zonder de pellets te storen. Voeg vervolgens een milliliter ijskoude, 4%paraformaldehyde toe aan de organoïden voor een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius. De volgende ochtend, vervang het fixatief met een milliliter kamertemperatuur PBS voor een vijf minuten incubatie bij kamertemperatuur en was de organoïden door centrifugatie drie keer.

Na de laatste wasbeurt, resuspend de organoïden in een milliliter van 30%ethanol voor een vijf minuten incubatie bij kamertemperatuur, gevolgd door een vijf minuten incubatie in een milliliter van 70%ethanol bij kamertemperatuur. Verzamel aan het einde van de 70%ethanol incubatie de organoïden door centrifugatie en roep de organoïden vijf minuten bij kamertemperatuur opnieuw op in één milliliter ethanol van 100%. Aan het einde van de 100% ethanol incubatie, warmte specimen verwerking gel in een magnetron gedurende 20 seconden of tot vloeibaar, en voeg 50 microliter van de vloeibaar gel aan elke buis van organoïden.

Plaats de buizen op ijs totdat de monsterverwerkingsgel is gestold en breng de druppel organoïden van elke buis naar tussen de blauwe sponspads in een cassette voor verdere verwerking in de paraffineinvent. Plaats de cassette in een weefselprocessor die gedurende 15 minuten per stap is geprogrammeerd en verdeel vervolgens de paraffine-embedded organoïden in specimen processing gel op vier micrometer per sectie voor immunohistochemische kleuring en analyse volgens standaardprotocollen. Extrahepatische galkanaal organoïde beplating efficiëntie is ongeveer 2%wanneer geïsoleerd van neonatale of volwassen muizen.

Na passage twee neemt de beplatingsefficiëntie van extrahepatische galkanaalorganoïden afkomstig van volwassen muizen toe tot 11% en blijft stabiel. De meerderheid van de organoïden tonen een cystische morfologie in alle passages met zeldzame onregelmatige organoïden. De organoïden bereiken een groeipiek op vijf tot zeven dagen, waarna ze intraluminale puin beginnen op te hopen en verslechteren.

Daarom moeten de organoïden voor het behoud van de organoïdecultuur om de zeven tot tien dagen worden gesplitst. Wanneer geanalyseerd met immunofluorescentie, extrahepatische galkanaal organoïden bestaan uit een zuivere populatie van epitheliale cellen gekenmerkt door E-cadherine. Organoïde cellen tonen ook markers van galverervercellen evenals markers van galdifferentiatie.

Belangrijk is dat een hoog percentage organoïde cellen een primair cilium bezit dat wordt gekenmerkt door geacetyleerde alfa Tubulin, wat een kenmerk is van normale cholangiocyten en een geschikte organoïde celpolarisatie suggereert. Nauwe naleving van de beschreven temperatuur is vereist. Nauwgezete galwegendissectie voorkomt bodemverontreiniging van de alvleeskliercel.

Het verlies van cellulair materiaal kan worden vermeden door zorgvuldige manipulatie na centrifugatie. Deze organoïden kunnen worden gebruikt als preklinische modellen, genetisch en farmacologisch gemanipuleerd, of gebruikt om drugs en de effecten van infectieuze stoffen te testen. Deze methode kan worden gebruikt door laboratoria die willen profiteren van genetisch gemodificeerde muismodellen om de mechanismen van cholangiocyte biologie verder te bestuderen.