Genetics
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哺乳动物细胞中基于CRISPR的聚集基因屏幕
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Summary September 4th, 2019
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CRISPR-Cas9技术提供了一种有效的方法，可以精确编辑任何细胞类型的哺乳动物基因组，并代表一种执行全基因组基因筛选的新方法。此处提供了一个详细的协议，讨论成功执行池全基因组 CRISPR-Cas9 屏幕所需的步骤。
Transcript
CRISPR筛选的辍学屏幕为研究人员提供了一种简单、高效、廉价的方法来在全基因组水平上检测链功能。CRISPR 的优点在于只需更改引导序列即可编辑任何基因。CRISPR指南库使研究人员能够以公正、系统的方式在一个实验中对任何生物体的整个基因组进行询问。
目前，CRISPR屏幕正被用于识别数百种人类癌症的基本基因，并绘制基因相互作用图。屏幕还可以全面描述药物，以揭示药物的行动机制。此处描述的 CRISPR 库以人类细胞为目标。
但是，针对其他物种（如小鼠）的指南库可用，也可以进行类似的筛选。在人类细胞中执行全基因组筛选在实践中可能令人望而生畏，因为它涉及处理数千万个细胞，并且需要分析大量数据。在启动屏幕之前，请确保对单元格系进行仔细描述。
这包括了解细胞系的纯度、加倍的时间、扁病毒转导效率以及抗生素选择剂的敏感性。可视化演示将提供有关如何实际处理屏幕中所需的数百万个单元格的图片，并系统地跟踪数千个扰动。演示这个程序的将是安德里亚·哈布西德、卡马尔迪普·奥拉赫和瑞安·克利米，他们都是我实验室的技术人员。
首先将现成的CRISPR sgRNA质粒转化为电镀细胞，然后根据手稿说明进行生长。当准备收获菌落时，在每个盘子中加入七毫升的 LB 与卡贝尼西林，用细胞扩散器刮掉菌落。使用 10 毫升移液器将刮过的细胞转移到无菌的一升锥形烧瓶中，然后用五毫升 LB 用卡贝尼西林冲洗盘子。
再次，将冲洗溶液转移到烧瓶中。根据手稿方向将细胞离心，然后确定湿颗粒的重量。使用 Maxi 或巨型质粒纯化试剂盒纯化质粒 DNA。
通过播种293个T细胞并孵育过夜，为转染细胞做好准备。第二天，为15厘米的板准备三个转染质粒混合物。计算一次转染所需的质粒量，并混合质粒，使要转染的板数加上一个质粒。
接下来，为每种转染和等分减少血清介质准备一个基于脂质的转染试剂，并放入单独的1.5毫升微离质管中，用于要转染的板数。加入转染试剂，轻轻混合，在室温下孵育五分钟。孵育后，以转染试剂与DNA复合物微克的三比一的比例将脱氧核糖核酸加入转染试剂。
轻轻混合溶液，在室温下离开30分钟。将转染混合物加入包装细胞，根据手稿说明孵育。在病毒收获当天，检查细胞的异常和融合形态，作为良好病毒产生的迹象，通过收集上根液并转移到无菌离心管中来收获扁病毒。
首先选择要在整个屏幕中保持的 CRISPR 指南 RNA 库覆盖率。根据库覆盖率，确定每个引导RNA维持该细胞所需的细胞数和MOI 0.3感染所需的细胞数。接下来，确定设置感染所需的板数，然后，收获细胞并播种到每个板。
将六溴甲基溴添加到所有板块中，并将所需的病毒量添加到筛选和控制两个板块中。不要添加病毒来控制病毒。将该卷替换为介质。
通过倾斜将板彻底混合，将板放入培养箱中，确保板是水平的。根据手稿方向收集受感染的细胞，从池状细胞中收集三个细胞颗粒，用于基因组 DNA 提取。将细胞以500倍g离心5分钟，用PBS清洗。
标记管子，并在零下 80 摄氏度处将细胞颗粒冷冻干燥。将受感染的细胞池拆分为三个复制组，确保在每个复制中保持库覆盖率。以膨胀时通常使用的密度为细胞播种。
对每个复制使用相同数量的单元格，并在复制之间使用相同的单元格总数。继续通过细胞，从池状受感染细胞的每个复制中收获三个细胞颗粒，最多15至20个细胞翻倍。在每个通道，收获细胞从每个板之间的所有细胞相互复制。
用时间标记每个颗粒并复制指定。根据手稿方向设置 PCR1，每 50 微升反应 3.5 微克基因组 DNA，总共 100 微克基因组 DNA，并设置相同的 50 微升反应，以实现所需的覆盖。根据稿稿说明设置一个PCR管反应。
使用池 PCR1 产品的五个微升作为模板，并每个样本使用唯一的索引底像组合，以允许对测序库样本进行池化。完成 PCR 后，在低电压下在 2%的加糖凝胶上运行 PCR 管产品 1 至 1 1~2 小时。在蓝光透光器上可视化产品，并切除 200 基对带。
使用分光光度计和荧光计净化DNA并测量其数量和质量。理想的导向RNA库应以相似数量表示每个引导RNA。下一代测序可用于确认库具有紧密的指南RNA分布。
精密召回分析可用于评估屏幕性能。高性能屏幕应以大于 6 的基因子恢复大量基本基因，且误发现率小于 5% 精度-召回曲线应具有锋利的肘部和一条直线到终点。贝叶斯因子表示基因敲除导致健身缺陷的置信度。
高分表明信心增强，而低分表示基因敲除具有生长优势。全基因组的敲除池可以在过量的药物代理存在的情况下进行培养，以寻找抑制剂抗药性基因。为了对胸腺素块的抑制器执行正选择屏幕，T0 上所有引导 RNA 的规范化读取计数根据胸腺素处理样品的均等规范化读取计数绘制。
成功执行CRISPR屏幕的一个关键细节是保持每个引导RNA的良好分布，从质粒的转染到细胞的转导。这将最大限度地减少随机效应的机会，这些随机效应可能扭曲引导RNA表示，并导致误报或阴性结果。在屏幕验证之后，应进行实验以确认命中，因为主屏幕只识别潜在的命中。
根据命中的生物学，可以使用各种方法。CRISPR编辑与下一代测序相结合，使各种人类模型系统中的功能屏幕的基因组尺度丢失。由于CRISPR的简单性，这些类型的屏幕现在可供所有研究人员广泛访问，使更多的科学家能够利用功能性遗传方法来研究生物过程和疾病。
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