Gepoolde CRISPR-gebaseerde genetische schermen in zoogdiercellen

CRISPR gescreende drop-out schermen bieden onderzoekers een eenvoudige, efficiënte en goedkope methode om de ketenfunctie op genoombreed niveau te ondervragen. Het voordeel van CRISPR is de pliability om elk gen te bewerken door simpelweg de geleidesequentie te veranderen. CRISPR-gidsbibliotheken stellen onderzoekers in staat om het hele genoom van een organisme in één experiment op een onbevooroordeelde, systematische manier te ondervragen.

Momenteel worden CRISPR-schermen gebruikt om essentiële genen in honderden menselijke kankers te identificeren en genetische interacties in kaart te brengen. Schermen kunnen ook volledig profiel drugs om drugs mechanismen van actie te onthullen. De HIER beschreven CRISPR-bibliotheken richten zich op menselijke cellen.

Handleidingbibliotheken die zich richten op andere soorten, zoals muis, zijn echter beschikbaar en kunnen op dezelfde manier worden gescreend. Het uitvoeren van genoombrede schermen in menselijke cellen kan in de praktijk ontmoedigend zijn, omdat het gaat om de behandeling van tientallen miljoenen cellen en vereist analyse van grote sets gegevens. Voordat u een scherm start, moet u ervoor zorgen dat de cellijnen zorgvuldig worden gekarakteriseerd.

Dit omvat het kennen van de zuiverheid van uw cellijn, verdubbelingstijd, lentivirus transductie-efficiëntie, en gevoeligheden voor antibiotica selectiemiddelen. Een visuele demonstratie geeft een beeld van hoe je praktisch omgaat met de miljoenen cellen die nodig zijn in een scherm en op systematische wijze duizenden verstoringen bijhouden. Het aantonen van de procedure zal Andrea Habsid, Kamaldeep Aulakh, en Ryan Climie, alle technici van mijn laboratorium.

Begin met het transformeren van de kant-en-klare CRISPR sgRNA plasmid in elektrocompetent cellen en groeien ze volgens manuscript richtingen. Wanneer klaar om de kolonies te oogsten, voeg zeven milliliter LB met carbenicilline aan elke plaat en schraap de kolonies af met de celstroder. Gebruik een pipet van 10 milliliter om de geschraapte cellen over te brengen in een steriele conische kolf van één liter en spoel de plaat af met vijf milliliter LB met carbenicilline.

Breng de spoeloplossing opnieuw over op de kolf. Centrifugeren de cellen volgens manuscript richtingen, en dan, bepalen het gewicht van de natte pellet. Zuiver het plasmide DNA met behulp van een Maxi of Mega schaal plasmid zuivering kit.

Bereid cellen voor op transfectie door 293 T-cellen te zaaien en ze ‘s nachts uit te broeden. Bereid de volgende dag het drie transfectieplasmidemengsel voor platen van 15 centimeter. Bereken de hoeveelheid plasmide die nodig is voor een transfectie en maak een mix van plasmiden voor het aantal platen, plus een, te transfecteren.

Bereid vervolgens een op lipide gebaseerde transfectiereageagens voor elke transfectie en aliquot-verlaagde serummedia in afzonderlijke 1,5 milliliter microcentrifugebuizen voor het aantal platen dat moet worden doorgesneden. Voeg het transfectiereagens toe, meng voorzichtig en broed vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg na de incubatie DNA toe aan het transfectiereagens bij een drie-op-één verhouding van transfectiereagensagens tot microgrammen DNA-complex.

Meng de oplossing voorzichtig en laat 30 minuten op kamertemperatuur. Voeg het transfectiemengsel toe aan verpakkingscellen en ontcubeer ze volgens de handschriftaanwijzing. Op de dag van de virale oogst, controleer de cellen op abnormale en gesmolten morfologie als een indicatie van een goede virusproductie, en oogst het lentivirus door het verzamelen van de supernatant en het overbrengen van het naar een steriele centrifuge buis.

Begin met het selecteren van de CRISPR-gids RNA-bibliotheekdekking die op het hele scherm moet worden onderhouden. Op basis van de dekking van de bibliotheek, bepalen het aantal cellen die nodig zijn om het te onderhouden per gids RNA en het aantal cellen die nodig zijn voor infectie op MOI 0.3. Bepaal vervolgens het aantal platen dat nodig is om de infectie op te zetten en vervolgens de cellen op elke plaat te oogsten en te zaaien.

Voeg hexadimethrine bromide toe aan alle platen en voeg het vereiste virusvolume toe om twee platen te screenen en te controleren. Voeg geen virus toe om er een te controleren. Vervang dat volume door media.

Meng de platen grondig door te kantelen en plaats de platen in een couveuse, zodat ze vlak zijn. Oogst geïnfecteerde cellen volgens manuscriptaanwijzingen en verzamel drie replica’s van celpellets uit de gepoolde cellen voor genomische DNA-extractie. Centrifugeren de cellen op 500 keer g gedurende vijf minuten en was ze met PBS.

Label de buizen en vries droog de cel pellets op min 80 graden Celsius. Splits de groep geïnfecteerde cellen op in drie gerepliceerde groepen, zodat u de dekking van de bibliotheek binnen elke replicaten behoudt. Zaad de cellen op een dichtheid die normaal gesproken zou worden gebruikt bij het uitbreiden van hen.

Gebruik hetzelfde aantal cellen voor elke repliceren en hetzelfde totale aantal cellen tussen replica’s. Doorgaan met de doorgang van de cellen en oogst drie replica’s van celpellets uit elke replicate van gepoolde geïnfecteerde cellen voor maximaal 15 tot 20 celverdubbelingen. Bij elke passage, oogst de cellen van alle platen in elke repliceren met elkaar.

Label elke pellet met de tijd en repliceren aanduiding. Stel PCR1 op volgens de handschriftaanwijzing met in totaal 100 microgram genomisch DNA op 3,5 microgram genomisch DNA per 50-microliterreactie en stel identieke 50-microliterreacties op om de gewenste dekking te bereiken. Stel één PCR buisreactie volgens manuscriptrichtingen in.

Gebruik vijf microliter van het gepoolde PCR1-product als sjabloon en gebruik unieke indexprimercombinaties voor elk afzonderlijk monster om het bundelen van sequencing-bibliotheekmonsters mogelijk te maken. Na het voltooien van de PCR, voer de PCR buis product op een 2%agarose gel bij lage spanning voor een tot 1 1/2 uur. Visualiseer het product op een blauw licht transilluminator en accijns op de 200 base pair band.

Zuiver het DNA en meet de kwantiteit en kwaliteit met zowel een spectrofotometer als een fluorometer. Een ideale gids RNA bibliotheek moet elke gids RNA vertegenwoordigd op vergelijkbare hoeveelheden. De volgende generatie sequencing kan worden gebruikt om te bevestigen dat de bibliotheek een strakke distributie van gids RNAs heeft.

Precisiehernvoudige analyse kan worden gebruikt om de schermprestaties te evalueren. Een goed presterend scherm moet een groot aantal essentiële genen herstellen met een basisfactor groter dan zes en een valse detectiesnelheid van minder dan 5%De precisieherinneringscurve moet een scherpe elleboog en een rechte lijn naar het eindpunt hebben. De Bayes factor vertegenwoordigt een vertrouwensmaat dat het gen knock-out resulteert in een fitness defect.

Hoge scores wijzen op meer vertrouwen, terwijl lage scores suggereren dat de gen knock-out groeivoordelen biedt. Genoom-brede knock-out zwembaden kunnen worden gekweekt in de aanwezigheid van overtollige drug agent om te zoeken naar suppressor resistentie genen. Om een positief selectiescherm voor suppressor van thymidineblok uit te voeren, worden de genormaliseerde gelezen tellingen voor alle gidsRNAs bij T0 uitgezet tegen gemiddelde-genormaliseerde gelezen tellingen voor thymidine-behandelde steekproeven.

Een belangrijk detail voor het succesvol uitvoeren van CRISPR-schermen is het handhaven van een goede verdeling van elke gids RNA, vanaf transfectie van het plasmide tot transductie van cellen. Dit minimaliseert de kans op willekeurige effecten die gids RNA representatie kunnen scheeftrekken en leiden tot vals-positieve of negatieve resultaten. Na een schermvalidatie moeten experimenten worden uitgevoerd om treffers te bevestigen, omdat het primaire scherm alleen potentiële treffers identificeert.

Afhankelijk van de biologie van de hits kunnen verschillende methoden worden gebruikt. CRISPR-bewerking, gecombineerd met de volgende generatie sequencing, heeft genoom-schaal verlies van functieschermen in diverse menselijke modelsystemen mogelijk gemaakt. Door de eenvoud van CRISPR zijn dit soort schermen nu breed toegankelijk voor alle onderzoekers, waardoor meer wetenschappers functionele genetische methoden kunnen gebruiken om biologische processen en ziekten te bestuderen.