Samlede CRISPR-baserede genetiske skærme i pattedyrsceller

CRISPR screenede drop-out skærme giver forskerne en enkel, effektiv og billig metode til at afhøre kædefunktion på genom-dækkende niveau. Fordelen ved CRISPR er dens smidighed til at redigere ethvert gen ved blot at ændre guidesekvensen. CRISPR guide biblioteker gør det muligt for forskere at afhøre hele genomet af enhver organisme i et eksperiment på en upartisk, systematisk måde.

I øjeblikket bruges CRISPR-skærme til at identificere vigtige gener på tværs af hundredvis af kræftkræfter hos mennesker og til at kortlægge genetiske interaktioner. Skærme kan også omfattende profil narkotika til at afsløre narkotika virkningsmekanismer. CRISPR-bibliotekerne, der er beskrevet her, er rettet mod menneskelige celler.

Men guide biblioteker rettet mod andre arter, såsom mus, er tilgængelige og kan screenes på samme måde. Udførelse af genom-dækkende skærme i menneskelige celler kan være skræmmende i praksis, da det indebærer håndtering af snesevis af millioner i celler og kræver analyse af store sæt data. Før du starter en skærm, skal du sørge for, at cellelinjerne er omhyggeligt karakteriseret.

Dette omfatter at kende renheden af din cellelinje, fordobling tid, lentivirus transduktion effektivitet, og følsomheder over for antibiotika udvælgelsesmidler. En visuel demonstration vil give et billede af, hvordan man praktisk talt håndtere de millioner af celler, der kræves på en skærm og holde styr på tusindvis af bekymringerr på en systematisk måde. Demonstration af proceduren vil være Andrea Habsid, Kamaldeep Aulakh, og Ryan Climie, alle teknikere fra mit laboratorium.

Begynd med at omdanne den færdige CRISPR sgRNA plasmid til elektrokompetente celler og dyrke dem i henhold til manuskriptretninger. Når du er klar til at høste kolonierne, tilsættes syv milliliter LB med carbenicillin til hver plade og skrabe kolonierne af med cellesprederen. Brug en 10-milliliter pipette til at overføre de skrabede celler i en steril en-liters konisk kolbe, og skyl pladen med fem milliliter LB med carbenicillin.

Igen overføres skylleopløsningen til kolben. Centrifuge cellerne i henhold til manuskript retninger, og derefter bestemme vægten af den våde pellet. Rens plasmid DNA ved hjælp af en Maxi eller Mega skala plasmid rensning kit.

Forbered celler til transfektion ved at så 293 T-celler og inkubere dem natten over. På den næste dag, forberede de tre transfektion plasmid blanding for 15-centimeter plader. Beregn den mængde plasmid, der er nødvendig for en transfektion, og lav en blanding af plasmider for antallet af plader, plus en, der skal transfekteres.

Dernæst forberedes et lipidbaseret transinfektionsreagens for hvert transfektions- og aliquot-reduceret serummedie til individuelle mikrocentrifugerør med 1,5 milliliter, så antallet af plader kan transfekres. Tilsæt transfektion reagens, bland forsigtigt, og inkuberes ved stuetemperatur i fem minutter. Efter inkubationen tilsættes DNA til transinfektionsreagesen ved et tre til et forhold af transinfektionsreages til mikrogram DNA-kompleks.

Opløsningen blandes forsigtigt og efterlades ved stuetemperatur i 30 minutter. Tilsæt transfektionsblandingen til emballageceller og inkuber dem i henhold til manuskriptretninger. På dagen for viral høst, kontrollere cellerne for unormal og sammensmeltet morfologi som en indikation af god virusproduktion, og høste lentivirus ved at indsamle supernatant og overføre det til en steril centrifuge rør.

Begynd med at vælge CRISPR-guide RNA-biblioteksdækningen, der skal bevares i hele skærmen. Baseret på biblioteksdækningen skal du bestemme antallet af celler, der kræves for at vedligeholde det pr. guide RNA, og antallet af celler, der kræves til infektion ved MOI 0,3. Dernæst bestemme antallet af plader, der kræves for at oprette infektionen og derefter høste og frø cellerne til hver plade.

Tilsæt hexadimethrine bromid til alle plader og tilsæt den nødvendige mængde virus til screening og kontrol to plader. Tilføj ikke virus for at styre en. Erstat den pågældende diskenhed med medier.

Bland pladerne grundigt ved at vippe og placere pladerne i en inkubator, og sørg for, at de er jævne. Høst inficerede celler i henhold til manuskript retninger og indsamle tre replikater af celle pellets fra de samlede celler til genomisk DNA-ekstraktion. Centrifuge cellerne ved 500 gange g i fem minutter og vask dem med PBS.

Mærl rørene og frys cellepillerne ved minus 80 grader Celsius. Opdel puljen af inficerede celler til tre replikerede grupper, og sørg for at bevare biblioteksdækningen i hver replikat. Frø cellerne med en tæthed, der normalt ville blive brugt, når de udvides.

Brug det samme antal celler for hver replikat og det samme samlede antal celler mellem replikater. Fortsæt med at passage cellerne og høste tre replikater af celle pellets fra hver replikeret af pooled inficerede celler i op til 15 til 20 celle fordoblinger. Ved hver passage høstes cellerne fra alle plader i hver repliker med hinanden.

Mærg hver pellet med tid og repliker betegnelse. Opsæt PCR1 i henhold til manuskriptretninger med i alt 100 mikrogram genomisk DNA ved 3,5 mikrogram genomisk DNA pr. 50-mikroliters reaktion, og opsæt identiske 50 mikrolitersreaktioner for at opnå den ønskede dækning. Opsæt en PCR rørreaktion i henhold til manuskriptanvisninger.

Brug fem mikroliter af det samlede PCR1-produkt som skabelon, og brug unikke indeksprimerkombinationer for hver enkelt prøve til at tillade gruppering af sekvensering af bibliotekseksempler. Efter at pcr-røret er fuldført, skal du køre PCR-rørproduktet på en 2% agarosegel ved lav spænding i en til 1 1/2 time. Visualiser produktet på en blåt lys transilluminator og punktafgifter de 200 base par band.

Rens DNA’et og mål dets kvantitet og kvalitet med både et spektrofotometer og et fluorometer. Et ideelt guiderna-bibliotek bør have hver eneste guide RNA repræsenteret ved lignende mængder. Næste generation sekventering kan bruges til at bekræfte, at biblioteket har en stram fordeling af guide RNA’er.

Præcisionskaldelsesanalyse kan bruges til at evaluere skærmens ydeevne. En højtydende skærm bør inddrive et stort antal væsentlige gener på en base faktor større end seks og en falsk opdagelse på mindre end 5%Præcision-tilbagekaldelse kurven bør have en skarp albue og en lige linje til terminalen punkt. Bayes-faktoren repræsenterer en tillidsforanstaltning, at gen knockout resulterer i en fitness defekt.

High scores indikerer øget tillid, mens lave scorer tyder på, at gen knockout giver vækst fordele. Genom-dækkende knockout puljer kan dyrkes i overværelse af overskydende lægemiddelagent til at lede efter suppressor resistens gener. For at udføre en positiv markeringsskærm for suppressor af thymidinblok afbildes normaliserede læsetællinger for alle guide-RNA’er ved T0 mod middelalnaliserede læsetal for thymidinbehandlede prøver.

En vigtig detalje for en vellykket udførelse af CRISPR skærme er at opretholde en god fordeling af hver guide RNA, startende fra transfection af plasmid til transduktion af celler. Dette vil minimere risikoen for tilfældige effekter, der kan skæve guide RNA repræsentation og føre til falske positive eller negative resultater. Efter en skærmvalidering skal der udføres eksperimenter for at bekræfte hits, fordi den primære skærm kun identificerer potentielle hits.

Afhængigt af biologi hits, kan forskellige metoder anvendes. CRISPR redigering, kombineret med næste generations sekventering, har gjort det muligt genom-skala tab af funktionsskærme i forskellige menneskelige modelsystemer. På grund af CRISPR’s enkelhed er disse typer skærme nu bredt tilgængelige for alle forskere, hvilket giver flere forskere mulighed for at udnytte funktionelle genetiske metoder til at studere biologiske processer og sygdomme.