Samlede CRISPR-baserte genetiske skjermer i pattedyrceller

CRISPR-skjermede drop-out-skjermer gir forskerne en enkel, effektiv og rimelig metode for å avhøre kjedefunksjonen på genomnivånivå. Fordelen med CRISPR er dens pliability å redigere et hvilket som helst gen ved ganske enkelt å endre føringssekvensen. CRISPR guide biblioteker gjør det mulig for forskere å avhøre hele genomet til enhver organisme i ett eksperiment på en objektiv, systematisk måte.

For tiden brukes CRISPR-skjermer til å identifisere essensielle gener på tvers av hundrevis av menneskelige kreftformer og for å kartlegge genetiske interaksjoner. Skjermer kan også profilere narkotika for å avsløre narkotika virkningsmekanismer. CRISPR-bibliotekene som er beskrevet her, retter seg mot menneskelige celler.

Guidebiblioteker rettet mot andre arter, for eksempel mus, er imidlertid tilgjengelige og kan screenes på samme måte. Å utføre genom-wide skjermer i menneskelige celler kan være skremmende i praksis, da det innebærer håndtering av titalls millioner i celler og krever analyse av store sett med data. Før du starter en skjerm, må du kontrollere at cellelinjer er nøye preget.

Dette inkluderer å vite renheten av cellelinjen din, doblingstid, lentivirustransduksjonseffektivitet og følsomhet for antibiotikavalgmidler. En visuell demonstrasjon vil gi et bilde av hvordan man praktisk talt håndterer de millioner av celler som kreves i en skjerm og holder styr på tusenvis av perturbations på en systematisk måte. Å demonstrere prosedyren vil være Andrea Habsid, Kamaldeep Aulakh og Ryan Climie, alle teknikere fra laboratoriet mitt.

Begynn med å forvandle den ferdige CRISPR sgRNA plasmid til elektrokomponentceller og dyrke dem i henhold til manuskriptretninger. Når du er klar til å høste koloniene, legg til syv milliliter LB med karbabinenicillin til hver tallerken og skrap koloniene av med cellesprederen. Bruk en 10-milliliter pipette til å overføre de skrapte cellene til en steril en liter konisk kolbe, og skyll platen med fem milliliter LB med karbabinenicillin.

Igjen, overfør skylleløsningen til kolben. Sentrifuge cellene i henhold til manuskriptretninger, og deretter bestemme vekten av den våte pellet. Rens plasmid DNA ved hjelp av en Maxi eller Mega skala plasmid rensing kit.

Forbered celler for transfection ved å så 293 T-celler og inkubere dem over natten. På neste dag forbereder du den tre transfection plasmidblandingen for 15-centimeter plater. Beregn mengden plasmid som trengs for en transfection og lag en blanding av plasmider for antall plater, pluss en, som skal transiseres.

Deretter forbereder du en lipidbasert transfection reagens for hver transfection og aliquot-redusert serum media i individuelle 1,5-milliliter mikrocentrifuge rør for antall plater som skal transiseres. Tilsett transfection reagens, bland forsiktig, og inkuber ved romtemperatur i fem minutter. Etter inkubasjonen, tilsett DNA til transfection reagensen ved et tre til ett forhold mellom transfection reagens til mikrogram DNA-kompleks.

Bland oppløsningen forsiktig og la den stå ved romtemperatur i 30 minutter. Tilsett transfection blandingen til emballasjeceller og inkubere dem i henhold til manuskriptretninger. På dagen for viral høst, sjekk cellene for unormal og smeltet morfologi som en indikasjon på god virusproduksjon, og høste lentivirus ved å samle supernatant og overføre den til et sterilt sentrifugerør.

Begynn med å velge CRISPR-veiledningen RNA-bibliotekdekning som skal vedlikeholdes i hele skjermen. Basert på bibliotekdekningen, bestemme antall celler som kreves for å opprettholde det per guide RNA og antall celler som kreves for infeksjon ved MOI 0.3. Deretter bestemmer du antall plater som kreves for å sette opp infeksjonen, og deretter høste og frø cellene til hver tallerken.

Tilsett heksametrinbromid til alle plater og tilsett det nødvendige volumet av virus for å screene og kontrollere to plater. Ikke legg til virus for å kontrollere en. Bytt det volumet med media.

Bland platene grundig ved å vippe og legg platene i en inkubator, og pass på at de er i nivå. Høst infiserte celler i henhold til manuskriptretninger og samle tre repliker av cellepellets fra de samlede cellene for genomisk DNA-ekstraksjon. Sentrifuger cellene ved 500 ganger g i fem minutter og vask dem med PBS.

Merk rørene og fryse tørke cellepellets på minus 80 grader Celsius. Del utvalget av infiserte celler i tre replikere grupper, og sørg for å opprettholde bibliotekdekningen i hver replikering. Seed cellene med en tetthet som normalt ville bli brukt når du utvider dem.

Bruk samme antall celler for hver replikering og samme totale antall celler mellom repliker. Fortsett å passere cellene og høste tre repliker av cellepellets fra hver replikering av samlede infiserte celler for opptil 15 til 20 celle doblinger. Ved hver passasje høster cellene fra alle platene i hver repliker med hverandre.

Merk hver pellet med tiden og repliker betegnelsen. Sett opp PCR1 i henhold til manuskriptretninger med totalt 100 mikrogram genomisk DNA ved 3,5 mikrogram genomisk DNA per 50 mikroliters reaksjon og satte opp identiske 50-mikroliterreaksjoner for å oppnå ønsket dekning. Sett opp en PCR-rørreaksjon i henhold til manuskriptretninger.

Bruk fem mikroliter av det samlede PCR1-produktet som en mal, og bruk unike indeks primerkombinasjoner for hvert enkelt utvalg for å tillate sammenlegging av sekvenseringsbibliotekeksempler. Etter å ha fullført PCR, kjør PCR-rørproduktet på en 2% agarose gel ved lav spenning i en til 1 1/2 timer. Visualiser produktet på en transilluminator med blått lys og avgiftsdirektoratet for 200 basisparbåndet.

Rens DNA og mål dens kvantitet og kvalitet med både et spektrofotometer og et fluorometer. En ideell guide RNA bibliotek bør ha hver enkelt guide RNA representert på lignende mengder. Neste generasjons sekvensering kan brukes til å bekrefte at biblioteket har en tett fordeling av guide RNA-er.

Presisjonstilbakekallingsanalyse kan brukes til å evaluere skjermytelsen. En skjerm med høy ytelse bør gjenopprette et stort antall essensielle gener med en basisfaktor som er større enn seks, og en falsk oppdagelsesfrekvens på mindre enn 5%Presisjonstilbakekallingskurven skal ha en skarp albue og en rett linje til terminalpunktet. Bayes-faktoren representerer et konfidenstiltak som genutslagsrunden resulterer i en kondisjonsfeil.

Høye score indikerer økt selvtillit, mens lave score tyder på at gennedslag gir vekstfordeler. Genom-wide knockout bassenger kan dyrkes i nærvær av overflødig legemiddelmiddel for å lete etter suppressor motstand gener. For å utføre en positiv utvalgsskjerm for suppressor av thymidinblokk, er normaliserte lesetall for alle guide-RNA-er ved T0 plottet mot gjennomsnittlig normaliserte lesetall for thymidinbehandlede prøver.

En viktig detalj for å utføre CRISPR-skjermer er å opprettholde god distribusjon av hver guide RNA, fra transinfeksjon av plasmid til transduksjon av celler. Dette vil minimere sjansen for tilfeldige effekter som kan forvrenge veilede RNA representasjon og føre til falske positive eller negative resultater. Etter en skjermvalidering bør eksperimenter gjøres for å bekrefte treff fordi hovedskjermen bare identifiserer potensielle treff.

Avhengig av biologien til treffene, kan ulike metoder brukes. CRISPR-redigering, kombinert med neste generasjons sekvensering, har aktivert genomskalatap av funksjonsskjermer i ulike menneskelige modellsystemer. På grunn av enkelheten til CRISPR er disse typene skjermer nå bredt tilgjengelige for alle forskere, slik at flere forskere kan bruke funksjonelle genetiske metoder for å studere biologiske prosesser og sykdom.