21,184 Views
•
00:09 min
•
September 04, 2019
DOI:
CRISPR-skärmade avhoppsskärmar ger forskarna en enkel, effektiv och billig metod för att förhöra kedjefunktionen på genomet.wide level. Fördelen med CRISPR är dess smidighet att redigera vilken gen som helst genom att helt enkelt ändra guidesekvensen. CRISPR guide bibliotek gör det möjligt för forskare att förhöra hela genomet av någon organism i ett experiment på ett opartiskt, systematiskt sätt.
För närvarande används CRISPR-skärmar för att identifiera viktiga gener över hundratals mänskliga cancerformer och för att kartlägga genetiska interaktioner. Skärmar kan också utförligt profil droger för att avslöja läkemedelsmekanismer för åtgärder. Crispr-biblioteken som beskrivs här riktar sig mot mänskliga celler.
Men guidebibliotek som riktar sig till andra arter, till exempel mus, är tillgängliga och kan visas på samma sätt. Att utföra genomomfattande skärmar i mänskliga celler kan vara skrämmande i praktiken, eftersom det innebär hantering av tiotals miljoner i celler och kräver analys av stora uppsättningar data. Innan du startar en skärm, se till att cellinjer noggrant karakteriseras.
Detta inkluderar att veta renhet din cellinje, fördubbling tid, lentivirus transduktion effektivitetsvinster, och känslighet för antibiotika urval agenter. En visuell demonstration kommer att ge en bild av hur man praktiskt taget hantera de miljontals celler som krävs i en skärm och hålla reda på tusentals perturbations på ett systematiskt sätt. Demonstrerar proceduren blir Andrea Habsid, Kamaldeep Aulakh, och Ryan Climie, alla tekniker från mitt laboratorium.
Börja med att omvandla den färdiga CRISPR sgRNA-plasmiden till elektrokompetenta celler och odla dem enligt manuskriptriktningar. När du är redo att skörda kolonierna, tillsätt sju milliliter LB med carbenicillin till varje platta och skrapa av kolonierna med cellspridaren. Använd en 10-milliliterpipett för att överföra de skrapade cellerna till en steril enliters konisk kolv och skölj plattan med fem milliliter LB med karbaticillin.
Återigen, överför sköljlösningen till kolven. Centrifugera cellerna enligt manuskriptet riktningar, och sedan, bestämma vikten av den våta pelleten. Rena plasmid-DNA:t med hjälp av en Maxi- eller Megaskala plasmidreningssats.
Förbered celler för transfektion genom att så 293 T-celler och inkubera dem över natten. På nästa dag, förbereda de tre transfektionsplasmid blandningen för 15-centimeter plattor. Beräkna mängden plasmid som behövs för en transfektion och gör en blandning av plasmider för antalet plattor, plus en, som ska transfekteras.
Därefter förbereda en lipid-baserade transfection reagens för varje transfection och alikvotera serum media i enskilda 1,5-milliliter microcentrifug rör för antalet plattor som ska transfekteras. Tillsätt transfektionsreagensen, blanda försiktigt och inkubera i rumstemperatur i fem minuter. Efter inkubationen, tillsätt DNA till transfektionsreagensen vid ett tre till ett förhållande mellan transfection-reagens till mikrogram DNA-komplex.
Blanda lösningen försiktigt och låt bli rumstemperaturen i 30 minuter. Tillsätt transfektionsblandningen i förpackningsceller och inkubera dem enligt manuskriptriktningar. På dagen för viral skörd, kontrollera cellerna för onormal och smält morfologi som en indikation på god virusproduktion, och skörda lentivirus genom att samla supernatant och överföra den till en steril centrifugrör.
Börja med att välja CRISPR-guidens RNA-bibliotekstäckning som ska upprätthållas under hela skärmen. Baserat på bibliotekets täckning, bestämma antalet celler som krävs för att upprätthålla den per guide RNA och antalet celler som krävs för infektion vid MOI 0,3. Därefter bestämma antalet plattor som krävs för att ställa in infektionen och sedan, skörda och utsäde cellerna till varje platta.
Lägg till hexadimetrine bromid till alla plattor och lägga till den nödvändiga volymen av virus för att screening och kontroll två plattor. Lägg inte till virus för att kontrollera en. Ersätt den volymen med media.
Blanda plattorna noggrant genom att luta och placera plattorna i en inkubator, se till att de är jämna. Skörda infekterade celler enligt manuskriptriktningar och samla in tre replikat av cellpellets från de poolade cellerna för genomisk DNA-extraktion. Centrifugera cellerna vid 500 gånger g i fem minuter och tvätta dem med PBS.
Märk rören och frys torrt cellpelletsen vid minus 80 grader Celsius. Dela poolen av infekterade celler till tre replikera grupper, se till att upprätthålla bibliotekstäckning inom varje replikat. Utsäde cellerna i en densitet som normalt skulle användas när expandera dem.
Använd samma antal celler för varje replikat och samma totala antal celler mellan replikat. Fortsätt att passage cellerna och skörda tre replikat av cell pellets från varje replikeras av poolade infekterade celler för upp till 15 till 20 cell fördubblingar. Vid varje passage, skörda cellerna från alla plattor i varje replikera med varandra.
Märk varje pellet med tids- och replikeringsbeteckningen. Ställ in PCR1 enligt manuskriptriktningar med totalt 100 mikrogram genomiskt DNA vid 3,5 mikrogram genomiskt DNA per 50-mikroliterreaktion och ställ in identiska 50-mikroliterreaktioner för att uppnå önskad täckning. Ställ in en PCR-rörreaktion enligt manuskriptriktningar.
Använd fem mikroliter av den poolade PCR1-produkten som en mall och använd unika indexprimerkombinationer för varje enskilt prov för att tillåta poolning av sekvenseringsbibliotekets prover. Efter att du har avslutat PCR kör du PCR-tubprodukten på en 2%agarosgel vid låg spänning i en till 1 1/2 timme. Visualisera produkten på en blå ljus transilluminator och punktskatt 200 basparet bandet.
Rena DNA:t och mät dess kvantitet och kvalitet med både en spektrofotometer och en fluorometer. Ett ideal vägleder RNA-arkiv bör ha varje singel vägleder RNA som föreställs på liknande antal. Nästa generations sekvensering kan användas för att bekräfta att biblioteket har en tät distribution av guide RNAs.
Precision-recall-analys kan användas för att utvärdera skärmens prestanda. En högpresterande skärm bör återvinna ett stort antal viktiga gener vid en basfaktor större än sex och en falsk upptäcktsfrekvens på mindre än 5% Precision-recall kurvan bör ha en skarp armbåge och en rak linje till terminalpunkten. Bayes-faktorn representerar ett förtroendemått som genen knockout resulterar i en fitness defekt.
Höga poäng indikerar ökat förtroende, medan låga poäng tyder på att genen knockout ger tillväxt fördelar. Genome hela knockout pooler kan odlas i närvaro av överskott läkemedel agent för att leta efter suppressor resistens gener. För att utföra en positiv urvalsskärm för suppressor av tymidinblock, är normaliserade läsantal för alla guide RNAs vid T0 plottade mot medelvärde-normaliserade läsantal för tymidinbehandlade prover.
En viktig detalj för att framgångsrikt utföra CRISPR-skärmar är att upprätthålla en god distribution av varje guide-RNA, från transfektion av plasmiden till transduktion av celler. Detta kommer att minimera risken för slumpmässiga effekter som kan skeva guide RNA representation och leda till falska positiva eller negativa resultat. Efter en skärmvalidering bör experiment göras för att bekräfta träffar eftersom den primära skärmen endast identifierar potentiella träffar.
Beroende på träffarnas biologi kan olika metoder användas. CRISPR-redigering, i kombination med nästa generations sekvensering, har möjliggjort genomskala förlust av funktionsskärmar i olika mänskliga modellsystem. På grund av enkelheten i CRISPR, dessa typer av skärmar är nu i stort sett tillgängliga för alla forskare, vilket gör att fler forskare att använda funktionella genetiska metoder för att studera biologiska processer och sjukdomar.
CRISPR-Cas9 teknik ger en effektiv metod för att exakt redigera däggdjur arvsmassan i någon celltyp och representerar ett nytt sätt att utföra genomomfattande genetiska skärmar. Ett detaljerat protokoll som diskuterar de steg som krävs för lyckad prestanda av poolade genomhela CRISPR-Cas9 skärmar finns här.
Read Article
Cite this Article
Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (151), e59780, doi:10.3791/59780 (2019).
Copy