Login processing...

JoVE Journal
Genetics

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Genetics

In-Nucleus Hi-C i Drosophila Cells

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Journal (Genetics)

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Journal (Genetics)

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Click here for the English version

In-Nucleus Hi-C i Drosophila Cells

Article DOI: 10.3791/62106-v

September 15th, 2021 •

Ayerim Esquivel-López¹, Rodrigo Arzate-Mejía¹, Rosario Pérez-Molina¹, Mayra Furlan-Magaril¹

¹Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

September 15th, 2021

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Genomet er organiseret i det nukleare rum i forskellige strukturer, der kan afsløres gennem kromosom kropsbygningsfangstteknologier. In-nucleus Hi-C-metoden giver en genomdækkende samling af chromatininteraktioner i Drosophila-cellelinjer, som genererer kontaktkort, der kan udforskes ved megabaseopløsning på begrænsningsfragmentniveau.

Transcript

Kernen Hi-C protokoller tillader udforskning af kromosomale bekræftelse ved forskellige opløsning for karakterisering af chromatin sløjfer, domæner, og rum organisere genomet. Denne protokol giver høj opløsning profilering af genomiske interaktioner på forskellige skalaer, hvilket giver en mere ensartet dækning over hele spektret af genomiske afstande og data med mindre teknisk støj. At kombinere denne protokol med genetisk redigering er en stærk strategi for test af genetiske elementers strukturelle funktion.

Det kan også anvendes til karakterisering af strukturelle variationer, der fører til sygdom. Kernen Hi-C-protokollen kan anvendes til at udforske genomorganisationen af ethvert eukaryote genom. Gør SDS og Triton behandling opdeler eventuelle nukleare klumper ved pipettering som aggregater forstyrre enzymatisk reaktion effektivitet, og sørg for at udføre passende kvalitetskontrol foranstaltning forud for sekventering.

Begynd med at tilsætte methanolfri formaldehyd til en gang 10 til de syv Schneiders Line 2 Plus Drosophila-celler i 17,5 milliliter Schneider-medium suppleret med 10% FBS til en endelig koncentration på 2%Inkuber cellerne i 10 minutter ved stuetemperatur med blanding hvert 60. og tilsæt glycin til en endelig koncentration på 0,125 molar med blanding. Efter fem minutter ved stuetemperatur og 15 minutter på is opsamles cellerne ved centrifugering, og pelletpens forsigtigt opsuges i 25 milliliter kold PBS, og cellerne opsamles med en anden centrifugering. Ved afslutningen af centrifugeringen opsuges cellerne i en milliliter iskold lysisbuffer til optælling og justeres cellerne til en 1 gange 10 til de seks celler pr. milliliterkoncentration.

Inkuber cellerne på is i 30 minutter, invertere røret hvert andet minut for at blande og samle cellerne med en anden centrifugering. Genbrug pellet i en milliliter frisk iskold lysis buffer. Efter centrifugering vaskes lysatet med en milliliter 1,25X begrænsningsbuffer.

Centrifuge igen for at indsamle lysatet. Genbrug pellet i 360 mikroliter af frisk begrænsning buffer og 11 mikroliter på 10% SDS med omhyggelig pipettering og inkubere i 45 minutter ved 37 grader Celsius og 7 til 950 omdrejninger i minuttet med lejlighedsvis pipetting. Ved afslutningen af inkubationen skal du stoppe gennemtrængningen med 75 mikroliter non-ionic overfladeaktivt middel og returnere røret til inkubatoren i yderligere 45 minutter med rysten ved 950 omdrejninger i minuttet med lejlighedsvis pipettering.

For chromatin fordøjelse, tilsæt 200 enheder af Mbo1 til røret for en fire til 16-timers inkubation ved 37 grader Celsius med rotation. I slutningen af inkubationen inaktiveres enzymet med 20 minutters inkubation ved 60 grader Celsius. For at udfylde begrænsningsfragmentets udhæng og for at mærke DNA-enderne med biotin, der tilsættes 1,5 mikroliter hver af 10 millimolar dCTP, dGTP, dTTP, 20 mikroliter på 0,4 millimolar biotin dATP, 17,5 mikroliter tris lav EDTA buffer, og 10 mikroliter af fem enheder pr mikroliter DNA polymerase et stort fragment til røret med omhyggelig blanding.

Inkuber reaktionen i 75 minutter ved 37 grader Celsius med rysten ved 700 omdrejninger i minuttet hvert 10. sekund i 30 sekunder. I slutningen af inkubationen tilsættes ligationsblandingen til kromatinen og justeres til et milliliter endeligt reaktionsvolumen med grundig blid blanding og inkubat natten over ved 16 grader Celsius. For at nedbryde prøveproteinerne tilsættes 50 mikroliter på 10 milligram pr. milliliter proteinase K til røret for en to timers inkubation ved 37 grader Celsius.

Ved afslutningen af inkubationen skal temperaturen øges til 65 grader Celsius natten over for at vende krydslinke prøven. Næste morgen nedbrydes RNA'et med 10 mikroliter på 10 milligram pr. milliliter RNAse A.Efter en time ved 37 grader Celsius tilsættes et volumen phenolchloroform til røret og blandes grundigt ved inversion for at opnå en homogen hvid fase. Efter at have udfældet DNA'et i henhold til standardprotokollerne, kvantificere DNA'et ved hjælp af et fluorogent farvestof, der selektivt binder sig til DNA og et fluorometer i henhold til producentens anvisninger.

For at rense DNA'et fra ufordøjede og fordøjede aliquots skal du indlæse 100 nanogram ufordøjede, fordøjede og ligated prøver på en 1,5% agarose gel og kigge efter en smøre centreret omkring 500 basepar i den fordøjede prøve versus et højt molekylvægtbånd til ligatedprøven. For at kontrollere Hi-C-mærkningen og ligationens effektivitet ved forstærkning og fordøjelse af en kendt interaktion, efter PCR, skal du fordøje produkterne med Mbo1, Cla1 eller begge dele og køre prøverne på en ny 1,5 til 2%gel for at muliggøre estimering af det relative antal 3C- og Hi-C-ligationskryds. Efter at have sonikeret prøven for at opnå DNA-fragmenter fra 200 til 500 basispar, overføre 130 mikroliter med fem mikrogram DNA fra hver prøve til nye mikrocentrifugerør, der indeholder 16 mikroliter 10X ligationsbuffer, to mikroliter på 10 millimolar dATP, fem mikroliter T4 DNA-polymerase og syv mikroliter dobbeltdestilleret vand til en 30-minutters inkubation ved 20 grader Celsius.

Ved afslutningen af inkubationen tilsættes fem mikroliter på 10 millimolar dNTP'er, fire mikroliter af 10X ligationsbuffer, fem mikroliter af T4 polynukleotidkinase, en mikroliter DNA-polymerase et stort fragment og 25 mikroliter dobbeltdestilleret vand til rørene i en anden 30-minutters inkubation ved 20 grader Celsius. For at vælge fragmenter for det meste i 250 til 550 base par størrelse rækkevidde, udføre sekventiel solid fase reversibel og mobilisering størrelse udvælgelse med 0,6X, derefter 0,9X i henhold til producentens anvisninger og elute DNA med 100 mikroliter af tris lav EDTA. For biotin pulldown for hvert bibliotek, vask 150 mikroliter af Streptavidin-forbundne magnetiske perler to gange med 400 mikroliter af 1X Tween buffer og rotere prøverne i tre minutter på et roterende hjul.

Ved afslutningen af inkubationen opsuspendes perlerne i 300 mikroliter på 2X no Tween buffer og blandes med 300 mikroliter Hi-C materiale for en 30-minutters rotation på et roterende hjul. Ved afslutningen af inkubationen vaskes perlerne med 400 mikroliter på 0,5 X Tween buffer for en tre minutters inkubation ved 55 grader Celsius og 750 omdrejninger i minuttet efterfulgt af to skiver i 200 mikroliter af 1X begrænsningsbuffer pr. Vask. Efter den anden vask, genbruges perlerne i 100 mikroliter af dATP tailing mix for en 30-minutters inkubation ved 37 grader Celsius.

Ved afslutningen af inkubationen opsuspendes perlerne i 50 mikroliter af 1X ligationsbuffer og overføres suspensionen til et nyt rør, der indeholder fire mikroliter forglødede parrede endeadaptere og to mikroliter af T4 ligase. Efter to timer ved stuetemperatur skal du fjerne supernatanten og vaske perlerne to gange med 400 mikroliter Tween buffer, og vask derefter perlerne en gang med 200 mikroliter uden Tween buffer og en gang med 100 mikroliter begrænsningsbuffer, før perlerne suspenderes igen i 40 mikroliter af 1X begrænsningsbuffer. En smøre på 200 til 1.000 base par er observeret, når begrænsning med Mbo1 er vellykket.

Hvis ligationen er vellykket, observeres et højt molekylvægtbånd øverst på gelen. Fordøjelseseffektiviteten kan også bekræftes af kvantitativ PCR. En acceptabel fordøjelseseffektivitet er 80% eller højere.

Som illustreret kan forstærkningen af en kendt mellemdistanceinteraktion i Hi-C-ligationsprodukter anslås ved fordøjelsen af pcr-produktet, der genvindes ved forstærkningen. En fordøjelseseffektivitet på mere end 70% anbefales for at undgå at have en stor del af ikke-nyttige læsninger til bibliotekerne efter sekventering. Antallet af PCR-cyklusser for den endelige forstærkning bør være en cyklus, der er mindre end antallet af cyklusser, for hvilke udstrygningen er synlig.

Bibliotekets fordøjelsesniveau angiver overfloden af gyldige Hi-C-par og afspejler andelen af nyttige læsninger, der vil blive hentet fra biblioteket. Ved hjælp af de entydige gyldige Hi-C-par kan der udføres grundlæggende analyse af parfordelingen. Som observeret i dette repræsentative eksempel kan NOTCH-gen locus ses sammen med de arkitektoniske proteiner, domæner et og to og histoneændringer langs locus.

Ved sletning af regionen, der indeholder både CTCF- og M1BP DNA-bindingssteder, kan der observeres en dramatisk ændring i chromatinkontakter. Efter Hi-C-eksperiment kan der udføres en for at nå et bestemt sæt kontakter, for eksempel fra promotorregioner. Dette er især nyttigt ved vurdering af store genomer.

Som påvist kan kombinationen af Hi-C-protokollen med genetisk tilsætning bruges til at vurdere genomiske elementers strukturelle og lovgivningsmæssige funktion.

X

Simple Hit Counter