Genetics
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Summary September 15th, 2021
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基因组在核空间中组织成不同的结构，可以通过染色体构象捕获技术揭示出来。核内Hi-C方法提供了在果蝇细胞系中全基因组的染色质相互作用集合，生成接触图，可以在限制片段水平下以兆基分辨率进行探索。
Transcript
核Hi-C协议允许以不同分辨率探索染色体确认，以描述组织基因组的染色质环、域和隔间。此协议提供不同尺度的基因组相互作用的高分辨率分析，在全范围基因组距离和具有较少技术噪声的数据上实现更一致的覆盖。将此协议与基因编辑相结合是测试遗传元素结构功能的有力策略。
它也可以应用于导致疾病的结构变异的表征。核Hi-C协议可用于探索任何真核基因组的基因组组织。做SDS和Triton处理通过管道分解任何核团块，因为聚合物干扰酶反应效率，并确保在测序前执行适当的质量控制措施。
首先，在施耐德介质的17.5毫升中加入1倍于10倍的无甲醇甲醛，在17.5毫升施耐德介质中加入果蝇细胞，最后浓度为2%，在室温下将细胞孵化10分钟，每60秒混合一次，或在旋转轮上混合一次， 并将甘油加入到混合的 0.125 摩尔的最终浓度中。在室温下5分钟和冰上15分钟后，通过离心收集细胞，并小心地将颗粒重新浸入25毫升的冷PBS中，并用另一个离心器收集细胞。离心结束时，将细胞重新吸纳在一毫升冰冷裂解缓冲器中，用于计数，并将细胞调整为每毫升浓度的1倍至6个细胞。
将细胞在冰上孵育30分钟，每两分钟倒置一次管子，用另一个离心器混合和收集细胞。将颗粒重新悬浮在一毫升新鲜冰冷裂解缓冲器中。离心后，用一毫升1.25倍的限制缓冲器清洗裂解液。
再次离心收集解液。将颗粒重新填充在 360 微升的新鲜限制缓冲器和 11 微升的 10% SDS 中，小心地在 37 摄氏度下管道和孵育 45 分钟，每分钟 7 到 950 转，偶尔吹笛。在孵化结束时，停止用 75 微升非离子表面活性剂的渗透，并将管子返回孵化器再 45 分钟，偶尔吹笛以每分钟 950 转的速度摇晃。
对于色素消化，在37摄氏度的旋转下，在管中加入200单位Mbo1，进行4至16小时的孵化。在孵化结束时，在60摄氏度下用20分钟的潜伏灭活酶。要填充限制片段悬垂和标记DNA结束与生物素， 加入1.5微升每10毫摩尔dCTP，dGTP，dTTP，20微升0.4毫摩尔生物素dATP，17.5微升三低EDTA缓冲器，和10微升5单位每微升DNA聚合酶一个大片段到管仔细混合。
在37摄氏度下将反应孵化75分钟，每10秒以每分钟700转的速度颤抖30秒。在孵化结束时，将结扎混合物添加到染色质中，并将其调整到一毫升最终反应体积，在 16 摄氏度下进行彻底的温和混合和孵育过夜。为了降解样品蛋白质，在37摄氏度的潜伏中加入50微升每毫升10毫克的蛋白质酶K。
在孵化结束时，将温度在夜间升高至65摄氏度，以扭转样品的交联。第二天早上，在37摄氏度下一小时后，用每毫升10毫克的10微升降解RNA，在管中加入一个体积的酚氯仿，通过反转彻底混合，获得同质白相。根据标准协议沉淀DNA后，使用有选择地与DNA结合的荧光染料和根据制造商说明的荧光仪对DNA进行量化。
为了从未消化和消化的碱液中清除DNA，将100毫微克未消化、消化和贴合的样品加载到1.5%的玫瑰凝胶上，并在消化的样品中寻找以500个碱基对为中心的涂片，而在消化的样品中寻找一个高分子量带。要通过放大和消化已知的相互作用来验证 Hi-C 标记和粘合效率，PCR 之后，用 Mbo1、Cla1 或两者兼有地消化产品，并在新的 1.5 到 2% 凝胶上运行样品，以便估计 3C 和高 C 结的相对数量。对样本进行测定后，获得200至500个碱基对DNA片段， 将每个样品中含有5微克DNA的130微升微升导管转移到新的微中心管中，其中含有16个10倍结结缓冲器的微升，2个10毫摩尔DATP微升，5个T4DNA聚合酶微升，以及7个双蒸馏水微升管，在20摄氏度下孵育30分钟。
在孵化结束时，在管子中加入5个10毫摩尔dNTP的微升、4个10倍结结缓冲的微升、5个T4多核苷酸激酶微升、1个DNA聚合酶的微升1个大片段和25个双蒸馏水微升，在20摄氏度下进行第二次30分钟的孵化。要选择主要在 250 到 550 基对大小范围内的片段，则使用 0.6 倍执行顺序固体相可逆和动员大小选择，然后根据制造商的说明选择 0.9 倍，然后使用 100 微升的三色低 EDTA 提取 DNA。对于每个库的生物素下拉，用 400 微升 1X Tween 缓冲器两次清洗 150 微升与斯特雷普塔维丁相连的磁珠，并在旋转轮上旋转样品三分钟。
在孵化结束时，将珠子重新用 300 微升的 2 倍无 Tween 缓冲器中重新使用，并与 300 微升高 C 材料混合，在旋转轮上旋转 30 分钟。在孵化结束时，用 400 微升 0.5 倍 Tween 缓冲器清洗珠子，在 55 摄氏度和每分钟 750 转时进行三分钟的孵化，然后在 200 微升中洗两次，每次洗涤 1 倍限制缓冲。第二次洗涤后，在 100 微升 dATP 尾矿混合物中重新吸收珠子，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。
在孵化结束时，将珠子重新注入1X结膜缓冲器的50微升中，并将悬浮液转移到一个新的管子中，该管包含4个微升前配对端适配器和2个T4韧带微升。在室温下两小时后，取出超强的珠子，用400微升的特温缓冲器洗珠两次，然后用200微升无特温缓冲器洗珠子，用100微升限制缓冲器洗珠子，然后用1倍限制缓冲器的40微升重新悬挂珠子。当 Mbo1 限制成功时，会观察到 200 到 1000 个碱基对的涂片。
如果连合成功，在凝胶顶部观察到高分子量带。消化效率也可以通过定量PCR得到证实。可接受的消化效率为 80% 或更高。
如前所述，通过消化放大中回收的 PCR 产品，可以估算高 C 粘合产品中已知中距离相互作用的放大。建议消化效率超过 70%，以避免在测序后为图书馆提供大量非有用的读物。最终放大的 PCR 周期数应少于可见涂片的周期数。
图书馆的消化水平表明有效高C对的丰富性，并反映了从图书馆获得的有用读物的比例。使用唯一有效的高 C 对，可以对配对分布进行基本分析。正如在这个具有代表性的例子中观察到的，NOTCH基因位点与建筑蛋白、域一和二以及沿位点的组蛋白修饰一起可见。
删除包含 CTCF 和 M1BP DNA 结合位点的区域后，可以看到染色质接触的戏剧性变化。在 Hi-C 实验之后，可以执行一个可以达到特定的接触集，例如，来自发起人区域。这在评估大型基因组时特别有用。
如前所示，将Hi-C协议与基因添加相结合可用于评估基因组元素的结构和调控功能。
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