De novo Identifisering av aktivt oversatte åpne leserammer med ribosomeprofileringsdata

Tolkning av sekvenseringsdataene generert av ribosomets profileringseksperiment er avgjørende for kvantitativ måling av translasjonsaktivitetene til ribosomer på mRNA, og for å studere mekanismene for translasjonsregulering. I denne protokollen vil vi beskrive beregningsprosedyren for bruk av ribosomets profileringsdata og RiboCode, et kommandolinjeverktøy for å dekode mRNA-oversettelse i genomomskala og enkelt nukleotidoppløsning. Denne metoden gjør det mulig å søke etter de nye peptidene som oppstår fra de genomiske områdene utenfor de kommenterte proteinkodingsgenene, og gir en mulighet til å kvantifisere frekvensen av mRNA-oversettelse.

For å begynne, åpne et Linux-terminalvindu, og opprett et conda-miljø ved å utføre kommandoen. Bytt til det opprettede miljøet, og installer RiboCode og avhengigheter ved å utføre kommandoen. Hvis du vil hente genomreferansefilene for referansesekvensen, går du til ensembl-nettstedet og klikker på last ned etterfulgt av FTP-nedlasting.

Klikk på FASTA-alternativet i kolonnen DNA FASTA, og velg raden der arten er menneskelig, vist i tabellen på nettsiden. På Ensembls nettside kopierer du lenken som nevnt i teksten, og deretter laster du ned og pakker ut filene i terminalen ved å utføre kommandoen. For referansemerknad, høyreklikk GTF i kolonnegensettene på den siste åpne nettsiden.

Kopier koblingen, og last den ned ved hjelp av kommandoen. Hvis du vil ha rRNA-sekvenser, åpner du UCSC-genomleseren, klikker verktøy og velger tabellleser i rullegardinlisten. På UCSC-genomlesersiden angir du pattedyr for clade, humant for genom, alle tabeller for gruppe, R-maske for bord og genom for region.

For filter klikker du opprett for å gå til en ny side, og angi rep-klasse som samsvarer med rRNA. Klikk Send, og sett deretter utdataformatet til sekvens, og utdatafilnavnet som HG38_rRNA. FA. Til slutt klikker du hent utdata, og deretter velger du hent sekvens for å hente rRNA-sekvensen.

Hvis du vil hente ribosomeprofileringsdatasett fra sekvenslesearkivet, laster du ned replikeringseksemplene for si-eIFe-behandlingsgruppen og gir dem nytt navn ved å utføre kommandoen. Last deretter ned replikeringseksemplene for kontrollgruppen, og gi dem nytt navn ved å utføre kommandoen. Hvis du vil fjerne rRNA-kontaminering, starter du indeksering av rRNA-referansesekvenser ved å utføre kommandoen.

Når du har indeksert, justerer du leseoperasjoner til rRNA-referanse for å utelukke at lesingene kommer fra rRNA ved å utføre kommandoen. Begynn med å opprette en genomindeks ved å utføre kommandoen. Juster deretter renlesningene uten rRNA-forurensning til den opprettede referansen ved å utføre kommandoen, og sorter og indekser deretter justeringsfiler ved å utføre kommandoen.

Klargjør transkripsjonsmerknadene ved å utføre kommandoen. Velg ribosomebeskyttede fragmenter av bestemte lengder, og identifiser deres P-områdeposisjoner ved å utføre kommandoen. Rediger konfigurasjonsfilene for hvert eksempel, og slå dem sammen.

Kjør deretter RiboCode ved å utføre kommandoen. Frekvensfordelingen av lengdene på lesningene viste at de fleste ribosolebeskyttede fragmenter tilsvarer 25 til 35 nukleotider. P-stedets plasseringer for forskjellige lengder av ribosomebeskyttede fragmenter ble bestemt ved å undersøke avstandene fra de fem hovedendene til de kommenterte start- og stoppkokonene.

Kartleggingsresultatene viser at 10 394 gener koder for kommenterte åpne leserammer. Videre koder 509 og 168 gener for oppstrøms og nedstrøms åpne leserammer, mens 939 gener koder for enten oppstrøms eller nedstrøms åpne leserammer, overlappet med kjente kommenterte åpne leserammer. Videre koder 68 proteinkodingsgener og 2601 ikke-kodegener for nye åpne leserammer.

Lengdefordelingen viste at oppstrøms, nedstrøms, roman og overlappende åpne leserammer var kortere enn de kommenterte åpne leserammene. Relative ribosomet beskyttede fragmenttall ble beregnet for hver åpne leseramme, og avslørte at ribosoletettheten til oppstrøms åpne leserammer var betydelig høyere i eIF3e mangelfulle celler enn i kontrollceller. Metageneanalysen viste at en masse ribosomer stoppet mellom torsk 25 og 75 nedstrøms startkodon, noe som tyder på at oversettelsesforlengelsen kan bli blokkert tidlig i eIF3e mangelfulle celler.

P-sites tetthetsprofiler for oppstrøms åpne leserammer av PSMA6 og nedstrøms åpne leserammer av gen SENP3-EIF4A1 ble undersøkt, og demonstrerte periodicitetsmønstre og tettheter av ribosole beskyttede fragmenter. Å sjekke plasseringen av lesninger rundt starten og stoppe codons av kjente proteinkodingsregioner er nødvendig for å evaluere de periodiske egenskapene til lesninger for hver lengde. RiboCode, sammen med et annet kommandolinjeverktøy, kan RiboMiner også utføre kvalitetskontroll og flere analyser som kvantifisering og visualisering av ribosomenes belegg på de anslåtte åpne leserammene.

Dette beregningsverktøyet gir en høy gjennomstrømningsmåte for å identifisere ukanoniske oversettelseshendelser med ribosomprofileringsdata i spesifikke fysiologiske sammenhenger, og hvordan oversettelsen modulerer som svar på stimulansen.