De novo זיהוי של מסגרות קריאה פתוחות בתרגום פעיל עם נתוני יצירת פרופילים של ריבוזום

פרשנות נתוני הרצף הנוצרים על ידי ניסוי פרופיל הריבוזום היא קריטית למדידה כמותית של הפעילות התרגומית של ריבוזומים ב- mRNA, וללימוד המנגנונים של רגולציה תרגומית. בפרוטוקול זה, נתאר את ההליך החישובי לניצול נתוני פרופיל הריבוזום ו- RiboCode, כלי שורת פקודה לפענוח תרגום mRNA בקנה מידה רחב הגנום ורזולוציית נוקלאוטיד בודדת. שיטה זו מאפשרת לחפש את הפפטידים החדשניים הנובעים מהאזורים הגנומיים מחוץ לגנים לקידוד חלבונים מובאים, ומציעה הזדמנות לכמת את קצב תרגום ה- mRNA.

כדי להתחיל, פתח חלון מסוף Linux וצור סביבת קונדה על-ידי ביצוע הפקודה. עבור לסביבה שנוצרה והתקן את RiboCode ואת יחסי התלות על-ידי ביצוע הפקודה. כדי לקבל את קבצי ההפניה לגנום עבור רצף ההפניות, עבור אל אתר האינטרנט של אנסמבל ולאחר מכן לחץ על הורד ולאחר מכן על הורדת FTP.

לחץ על האפשרות FASTA בעמודה DNA FASTA ובחר את השורה שבה מינים הם בני אדם, המוצגת בטבלה בדף האתר. בדף אתר האינטרנט של אנסמבל, העתק את הקישור כאמור בטקסט ולאחר מכן הורד ופתח את הקבצים במסוף על-ידי ביצוע הפקודה. לקבלת ביאור הפניה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על GTF בערכות הגנים של העמודות בדף האינטרנט הפתוח האחרון.

העתק את הקישור והורד אותו באמצעות הפקודה. כדי לקבל רצפי rRNA, פתח את דפדפן הגנום של UCSC ולאחר מכן לחץ על כלים ובחר דפדפן טבלה ברשימה הנפתחת. בדף דפדפן הגנום של UCSC, ציין יונק עבור clade, אדם לגנום, כל הטבלאות לקבוצה, מסכת R לשולחן וגנום לאזור.

עבור סינון, לחץ על צור כדי לעבור לדף חדש, והגדר מחלקת נציג בהתאם ל- rRNA. לחץ על שלח ולאחר מכן הגדר את תבנית הפלט לרצף ואת שם קובץ הפלט HG38_rRNA. FA. לבסוף, לחץ על קבל פלט ולאחר מכן בחר קבל רצף כדי לאחזר את רצף rRNA.

כדי לקבל ערכות נתונים ליצירת פרופילים של ריבוזום מארכיון קריאת רצף, הורד את הדוגמאות המשוכפלות של קבוצת הטיפול si-eIFe ושנה את שמן על-ידי ביצוע הפקודה. לאחר מכן הורד את הדוגמאות המשוכפלות של קבוצת הביקורת ושנה את שמן על-ידי ביצוע הפקודה. כדי להסיר זיהום rRNA, התחל ליצור אינדקס של רצפי הפניות rRNA על-ידי ביצוע הפקודה.

לאחר יצירת אינדקס, יישר את הקריאות להפניה ל- rRNA כדי לשלול את הקריאות שמקורן ב- rRNA על-ידי ביצוע הפקודה. התחל ביצירת אינדקס גנום על-ידי ביצוע הפקודה. לאחר מכן יישר את הקריאות הנקיות ללא זיהום rRNA להפניה שנוצרה על-ידי ביצוע הפקודה ולאחר מכן מיין ויישור קבצי יישור אינדקס על-ידי ביצוע הפקודה.

הכן את ביאורי התמליל על-ידי ביצוע הפקודה. בחר שברים מוגנים ריבוזום באורכים ספציפיים, וזיהה את מיקומי אתר P שלהם על-ידי ביצוע הפקודה. ערוך את קבצי התצורה עבור כל דוגמה ומזג אותם.

לאחר מכן הפעל את RiboCode על-ידי ביצוע הפקודה. התפלגות התדירות של אורכי הקריאות הראתה שרוב הקטעים המוגנים על ריבוזום תואמים ל -25 עד 35 נוקלאוטידים. מיקומי אתר P לאורכים שונים של שברים מוגנים ריבוזום נקבעו על ידי בחינת המרחקים מחמשת הקצוות העיקריים שלהם להתחלה המובאת ולעצירה קודונים.

תוצאות המיפוי מראות כי 10, 394 גנים מקודדים עבור מסגרות קריאה פתוחות עם הערות. יתר על כן, 509 ו -168 גנים מקודדים עבור מסגרות קריאה פתוחות במעלה ובמורד הזרם, בעוד 939 גנים מקודדים עבור מסגרות קריאה פתוחות במעלה הזרם או במורד הזרם, חופפים עם מסגרות קריאה פתוחות ידועות. יתר על כן, 68 גנים לקידוד חלבונים ו-2,601 גנים שאינם מקודדים עבור מסגרות קריאה פתוחות חדשניות.

התפלגות אורך הראתה כי במעלה הזרם, במורד הזרם, ברומן ובמסגרות הקריאה הפתוחות החופפות היו קצרות יותר ממסגרות הקריאה הפתוחות המובאות. ספירות שברים מוגנים יחסית של ריבוזום חושבו עבור כל מסגרת קריאה פתוחה, וחשפו כי צפיפות הריבוזום של מסגרות קריאה פתוחות במעלה הזרם היו גבוהות משמעותית בתאים לקויים eIF3e מאשר בתאי בקרה. ניתוח המטגן גילה כי מסה של ריבוזומים נתקעה בין קודונים 25 ו 75 במורד הזרם של קודון ההתחלה, מה שמצביע על כך שהארכת התרגום עשויה להיות חסומה בשלב מוקדם בתאים לקויים eIF3e.

פרופילי הצפיפות של אתרי P עבור מסגרות קריאה פתוחות במעלה הזרם של PSMA6 ומסגרות קריאה פתוחות במורד הזרם של הגן SENP3-EIF4A1 נבדקו, מדגימים את דפוסי המחזור ואת הצפיפות של שברים מוגנים ריבוזום. בדיקת המיקומים של קריאות סביב קודונים התחלה והפסקה של אזורי קידוד חלבון ידועים נחוצה להערכת המאפיינים התקופתיים של קריאות עבור כל אורך. RiboCode, יחד עם כלי שורת פקודה נוסף, RiboMiner יכול גם לבצע בקרת איכות וניתוחים מרובים כגון כימות והדמיה של תפוסות הריבוזומים על מסגרות הקריאה הפתוחות החזויות.

כלי חישובי זה מספק דרך תפוקה גבוהה לזהות אירועי תרגום לא קנוניים עם נתוני פרופיל ריבוזום בהקשרים פיזיולוגיים ספציפיים, וכיצד התרגום מווסת בתגובה לגירוי.