Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Biology
 

Summary

Wir beschreiben eine Methode, die die Kinetik von Ionen-Transport von Membranproteinen Maßnahmen neben site-spezifische Analyse von Konformationsänderungen mittels Fluoreszenz an einzelnen Zellen. Diese Technik ist anpassungsfähig an Ionenkanälen, Transportern und Ionenpumpen und kann genutzt werden, um Einschränkungen bei den Protein-Untereinheiten zu bestimmen.

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Richards, R., Dempski, R. E. Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling. J. Vis. Exp. (51), e2627, doi:10.3791/2627 (2011).

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Abstract

Zwei Elektroden Voltage-Clamp-Elektrophysiologie (TEVC) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um den Mechanismus von Ionen-Transport1 für eine Vielzahl von Membranproteinen einschließlich Ionenkanäle 2, Ionenpumpen 3 und Transporter 4 Untersuchen. Die jüngsten Entwicklungen haben ortsspezifische Fluorophor Kennzeichnung neben TEVC, gleichzeitig untersuchen Konformationsdynamik an bestimmten Rückständen und Funktion dieser Proteine ​​auf der Oberfläche der einzelnen Zellen zusammen.

Wir beschreiben eine Methode, um die konformative Dynamik von Membranproteinen durch die gleichzeitige Überwachung Fluoreszenz und aktuellen Änderungen mit Voltage-Clamp-Fluorometrie zu studieren. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um die molekulare Bewegung von Membranproteinen ortsspezifisch folgenden Cystein Ersatz-und ortsspezifische Fluorophor Kennzeichnung 5,6 untersuchen. Darüber hinaus liefert diese Methode eine Annäherung an Einschränkungen bei den spezifischen Rückstände 7,8 ermitteln. Dies wird durch selektives Anbringen Donor und Akzeptor Fluorophore zu zwei mutierte Cystein-Reste von Interesse erzielt.

In Kürze sind diese Versuche folgende funktionelle Expression des gewünschten Proteins auf der Oberfläche des Xenopus-Oozyten leavis durchgeführt. Die große Oberfläche dieser Eizellen ermöglicht einfache funktionelle Messungen und eine robuste Fluoreszenzsignal 5. Es ist auch möglich, ohne Änderung der extrazellulären Bedingungen wie pH, Liganden oder Kationen / Anionen, die weitere Informationen über den Mechanismus von Membranproteinen 4 kann liefern. Schließlich haben die jüngsten Entwicklungen auch die Manipulation der Auswahl der internen Ionen folgenden Co-Expression mit einem zweiten Protein 9 aktiviert.

Unser Protokoll ist in mehreren Teilen beschrieben. Zunächst ging Cystein-Scanning-Mutagenese von Fluorophor Kennzeichnung auf Rückstände an der Schnittstelle der Transmembran-und extrazellulären Domänen befindet sich abgeschlossen ist. Nachfolgende Experimente sind so konzipiert, Rückstände, die großen Veränderungen in der Fluoreszenz-Intensität (<5%) 3 zeigen, auf eine Konformationsänderung des Proteins zu identifizieren. Zweitens sind diese Veränderungen in der Fluoreszenz-Intensität auf die kinetischen Parameter des Membranproteins verglichen, um die konformative Dynamik, um die Funktion der Protein 10 zu korrelieren. Dies ermöglicht eine konsequente biophysikalische Analyse der molekularen Bewegung des Zielproteins. Schließlich können zwei Reste der Holoenzym mit einem Donor-und Akzeptor Fluorophor markiert werden, um Abstand Einschränkungen mit Spendersamen Photozerstörung Methoden zu bestimmen. Es ist auch möglich, die relative Bewegung von Protein-Untereinheiten nach Markierung mit einem Donor-und Akzeptor Fluorophor zu überwachen.

Protocol

1. Protein Expression

Clone der Membran Protein von Interesse in einen Vektor für Xenopus laevis Oozyten Ausdruck wie PtLn 11 oder pSG01MX 12. Optimierte Vektoren enthalten sowohl 5 'und 3' Xenopus laevis β-Globin untranslatierten Regionen 11,12, eine einzigartige Restriktionsstelle und ein RNA-Promotor vor Ort, bevor die 5 'UTR 11 befindet. Diese Komponenten sind für eine optimale Expression in Oozyten, Linearisierung des Plasmids vor mRNA-Synthese und mRNA-Synthese, bzw. erforderlich.

2. Cystein Mutation

  1. Ein Kyte-Doolittle Plot wird eingesetzt, um den Transmembrandomänen des Zielproteins zu identifizieren mit dem Protein der Aminosäuresequenz (ProtScale, ExPASy) 13. Die Daten werden als Hydrophobie vs Sequenz-Nummer angezeigt. Rückstände, die positive Werte angezeigt werden wahrscheinlich in der Transmembrandomäne gefunden. Verwenden Sie dieses Diagramm, um die wahrscheinlichste Rückstände an der Schnittstelle zwischen den Transmembran-und extrazellulären Domänen, die zu Cystein mutiert werden entfernt zu bestimmen. Da die Bestimmung der Schnittstelle der Transmembrandomäne und extrazellulären Region kann nicht mit absoluter Sicherheit mit der Kyte-Doolittle Plot vorhergesagt werden kann, ist es wichtig, eine Reihe von Rückständen, die voraussichtlich an der Schnittstelle sind, prüfen. Diese Region des Proteins für die vorhergesagte Bewegung der fluorophore.During eine Konformationsänderung ausgewählt ist, wird das Fluorophor zwischen einer hydrophilen und hydrophoben Umgebung oder zwischen einer mehr Wasser Abschrecken und weniger Wasser Abschrecken Umfeld zu bewegen. Jede dieser vorhergesagten Veränderungen in der Umwelt wird zu einer Änderung in der Fluoreszenzintensität führen.
  2. QuickChange Site-Mutagenese Kit (Stratagene) wird verwendet, um einzelne extrazellulär zugänglich Cystein-Konstrukte zu erzeugen. In kurzen, mix 5 ul 10x Reaktionspuffer, 2 &mgr; l 5 ng / ul Plasmid-DNA, 1,25 ul jeweils 100 ng / ul Forward-und Reverse-Primer, 1 ul dNTP (100 mM), und 39,5 ul zweifach destilliertem Wasser. Schließlich, fügen 1 ul PfuTurbo DNA-Polymerase (Stratagene). Die Primer für diesen Schritt verwendet werden, sollten mit dem Cystein Mutation an einer extrazellulären Rückstand von Interesse gestaltet werden.
  3. Programm einen Thermocycler, die folgenden Spezifikationen: 1 Zyklus bei 95 ° C für 30 Sekunden, 12-18 Zyklen bei 95 ° C für 30 Sekunden, 55 ° C für 1 Minute und 68 ° C für 1 Minute pro kb Plasmid Länge. Die Annealingtemperatur (55 ° C) wird direkt von der Schmelztemperatur der einzelnen Primer berechnet. Ein letzter Schritt kann so programmiert werden, um die Temperatur um 4 ° C zu halten, wenn die Reaktion über Nacht durchgeführt wird. Die Anzahl der Zyklen hängt von der Mutation. Verwenden Sie 12 Zyklen für Punktmutationen, 16 Zyklen für eine einzelne Aminosäure zu ändern, oder 18 Zyklen für mehrere Aminosäure-Insertionen.
  4. Add 1 ul DpnI (New England Biolabs) zu dem Reaktionsgemisch, durch Pipettieren gründlich mischen und zentrifugieren (6000 rpm) für 1 Minute. Inkubation für 1 Stunde bei 37 ° C im Wasserbad.
  5. Thaw Top-10 elektro-kompetenten Zellen (Invitrogen) auf Eis inkubieren sterile SOC Media (20 mg / ml Trypton, 5 mg / ml Hefe-Extrakt, 1 mg / mL NaCl, 0,4 mg / mL KCl, 0,02 M Mg 2 +, 0,02 M Glukose, ddH2O) bei 37 ° C bis zum Gebrauch. Aliquot 20 ul der Zellen in 1,5 ml Röhrchen und fügen 1 ul verdaute DNA in die Zellen.
  6. Füllen Sie den Cell-Porator (Life Technologies) mit Eiswasser, setzen sich die Kapazität auf 330 uF, Ladestrom, um schnell und Widerstand auf der Voltage-Booster bis 4 kOhm.
  7. Je 20 ul der Zelle / DNA-Lösung in Zell-porator Küvetten. Legen Sie die Küvetten in den Cell-Porator, den Deckel schließen, schließen Sie das Netzkabel, und das Rad drehen, um die richtige Küvette. Stellen Sie die Stromversorgung zum Aufladen und halten 'up', bis die Spannung liest 430. Drehen Sie das Rad auf den Arm und drücken auslösen. Wenn es einen Knall, wiederholen Sie die Elektroporation.
  8. Pipettieren Sie die Zellen aus der Küvette und übertragen Sie sie auf 1,5 ml SOC-Medium. Inkubieren für 1,5 Stunden bei 37 ° C unter Schütteln.
  9. Transfer-30 ul des SOC / Zelle Lösung LB / Ampicillin-Agarplatten (10 mg / mL Trypton, 5 mg / ml Hefe-Extrakt, 10 mg / mL NaCl, 15 mg / mL Agar, ddH 2 O und 100 ng / ul Ampicillin ). Verbreiten Sie die Zellen auf der Platte und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C über Nacht.
  10. Ernte einzelne Kolonien von den Platten und impfen 5 ml Kulturen mit LB / Ampicillin (10 mg / mL Trypton, 5 mg / ml Hefe-Extrakt, 10 mg / mL NaCl, 100 ng / ul Ampicillin ddH 2 O) Medien. Schütteln bei 37 ° C für 16-20 Stunden.
  11. Führen Sie einen DNA Miniprep mit dem NucleoSpin Plasmid Kit (Macherey-Nagel). Qualitativ begutachtet das Produkt durch Agarosegelelektrophorese. Quantitiate die Ausbeute an DNA mit einem Nanodrop 2000c Spektrophotometer (Thermo Scientific).
  12. Stellen Sie sicher, Einfügen von Mutationen durch DNA-Sequenzierung.

  1. Um die DNA-, Digest-3 ug von Plasmid-DNA in 50 L Reaktionsvolumen linearisieren mit 5 ul geeigneten Puffer und 1 ul Restriktionsenzym für 1 Stunde bei 37,0 ° C.
  2. Mit dem High-Pure PCR Produkt Purification Kit (Roche Applied Science), fügen Sie 350 &mgr; l Bindungspuffer auf die Verdauung Ampulle und kurz vortexen. Dieses Kit wird verwendet, da es guanidiniumisothiocyanate, die das Produkt RNA grade macht enthält.
  3. Ort Spin-Säulen in Sammelröhrchen und laden Sie die Spalte mit verdauen DNA-Lösung. Zentrifuge bei 18.000 g für 20 Sekunden und entsorgen Durchströmung.
  4. Add 500 ul Waschpuffer auf die Säule. Centrifuge 20 Sekunden bei 18.000 g und verwerfen durchströmen.
  5. Geben Sie 200 ul Waschpuffer auf die Säule. Centrifuge 30 Sekunden oder bis Spalte ist bei 18.000 trocken g.
  6. Legen Sie die Spin-Säule in einer autoklavierten 1,5 ml Zentrifugenröhrchen eingewogen und 50 ul DEPC-behandeltem Wasser auf die Säule. Eluieren durch Zentrifugation für 30 Sekunden bei 18.000 g.
  7. Konzentrieren der eluierten DNA auf ca. 15 ul, die in 0,5 ug in 3 ul Lösung ergibt.
  8. Wählen Sie die richtige mMessage mMachine Kit (Ambion) nach den Promotor site-Sequenz im Plasmid-DNA (SP6, T7). Add 5 ul 1 NTP-cap-Mix, 3 ul linearisierte DNA aus dem vorherigen Schritt, 1 ul Transkription Puffer und 1 ul der entsprechenden RNA-Polymerase. Inkubieren für 1,5-2 Stunden bei 37 ° C.
  9. Add 12,5 ul von LiCl aus Kit, 15 ul DEPC-Wasser, kurz mischen (nicht vortexen), Zentrifuge bei 11.000 g für 10 Sekunden, und bei -20 ° C für mindestens 30 Minuten für die Fällung.
  10. Pre-cool-Zentrifuge auf 4 ° C und Zentrifuge mindestens 15 Minuten bei voller Geschwindigkeit nach der Fällung.
  11. Nach der Zentrifugation eine braune Pellet sichtbar sein soll an der Unterseite des Rohres. Sorgfältig und vollständig zu entfernen Überstand und fügen 150 ul 70% RNA grade Ethanol gekühlt auf -20 ° C. Zentrifuge bei 4 ° C für 5 Minuten bei voller Geschwindigkeit.
  12. Entfernen Sie den Überstand vollständig, kurz trocknen (1-2 min) in einem Eppendorf Vacufuge Plus, und löst die nun weiße Pellet in 12 ul DEPC-Wasser. Quantitiate die Ausbeute an mRNA mit Hilfe eines Nanodrop 2000c Spektrophotometer (Thermo Scientific).

4. Oocyte Removal

  1. Dieses Protokoll wurde von Institutional Tiere WPI Care und Nutzung gebilligt worden ist.
  2. Vor dem Betrieb sollte der Frosch für 12 Stunden gefastet werden, um Erbrechen während der Operation zu verhindern.
  3. Machen Sie eine Lösung von 0,5-3,0 g MS-222 in Wasser gelöst. Add Natriumbicarbonat, bis die Lösung hat einen pH 7.0-8.0. MS-222 ist als Betäubungsmittel für den Frosch in der Chirurgie eingesetzt. Es ist wichtig, Nitril-Handschuhe zu jeder Zeit tragen beim Umgang mit MS-222 und bereiten die Lösung unter einem chemischen Haube
  4. Tauchen Sie den Frosch in der MS-222-Lösung, bis der Frosch aufrichtende und Zehen Prise Reflexe verloren hat. Um zu überprüfen, Teilnahmslosigkeit, kneifen die Zehe des Frosches.
  5. Setzen Sie den Frosch auf der Rückenseite auf die absorbierende Seite einer nassen Windel pad. Dies vermeidet Schäden an der Haut des Frosches. Halten Sie ein feuchtes Papiertuch in der Nähe des Frosches zu allen Zeiten, als der Frosch muss feucht gehalten während der Operation. Wenn die Augen des Frosches geöffnet sind, ist es wichtig, sie mit Kochsalzlösung befeuchten. Wenn der Frosch zeigt Anzeichen des Erwachens, gießen Sie die Narkose-Lösung auf den Frosch und warten, bis der Frosch nicht mehr reagiert. Führen Sie einen zweiten Zehe Prise vor der Fortsetzung des Verfahrens.
  6. Machen Sie eine kleine zölomischen Einschnitt entweder nach links oder rechts von der Frosch-Mittellinie. Einschnitte sollten wechselseitig mit anschließender Operationen vorgenommen werden.
  7. Bringen Sie den Eierstock an der Außenseite des Frosches und entfernen Sie den Eierstock. Berühren Sie nicht die Eierstöcke mit dem Frosch die Haut. Kommt es zu Blutungen, Druck mit einer sterilen Wattestäbchen, bis die Blutung aufhört.
  8. Suture der Schnitt mit einer unterbrochenen Naht Muster mit 3,0-4,0 Ethicon Vicryl Nahtmaterial (Johnson & Johnson). Wenn Nähen, verwenden Sie chirurgische Instrumente, um einen Knoten zu einem Zeitpunkt, zu binden und zu verhindern das Berühren der Haut des Frosches. Es ist auch wichtig, die zölomischen und Hautschichten getrennt Naht. Dies steht im Einklang mit den NIH-Richtlinien für die Ei-und Eizellgewinnung in Xenopus laevis (siehe: http://oacu.od.nih.gov/arac/XenopusOocyte_101007_Fnl.pdf ).
  9. Nach der Operation muss der Frosch nicht unterziehen Betrieb für mindestens 2 Monate. Es sollte auch festgestellt werden, ob der Frosch ist gesund genug, um nachfolgende Operationen zu unterziehen. Ein Maximum von 6 Operationen können auf jedem Frosch mit der 6 th Operation wird Terminal durchgeführt werden.

5. Oocyte Defoculation und mRNA Injection

  1. Die isolierte Eierstock-Lappen ist mit einer Schere in kleinere Teile aufgeteilt. Die Klumpen werden in Ringer-Lösung + Ca 2 + mit Kollagenase (8,6 übertrageng / L NaCl, 0,3 g / L KCl und 0,33 g / L CaCl 2).
  2. Schütteln Sie die Digest-Lösung für 2 Stunden bei 18 ° C. Wenn die meisten Eizellen getrennt sind, waschen Eizellen mit Ringer-Lösung - Ca 2 + (8,6 g / L NaCl und 0,3 g / L KCl). Inkubieren Oozyten für 10 Minuten in Ringer-Lösung - Ca 2 +.
  3. Transfer-Oozyten Ringer-Lösung + Ca 2 +.
  4. Inject Eizellen mit 25 ng der mRNA, in einem Endvolumen von 50 nL mit dem Nanoject II Auto-Nanoliter Injector (Drummond), mit 3,5 "Drummond Kapillaren. Hinweis: Die Menge an mRNA variiert je nach Zielprotein.
  5. Nach der Injektion inkubieren Oozyten 3-7 Tage in Ringer-Lösung (90 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM MOPS, 2 mM CaCl 2, pH 7,4) und 1 mg / mL Gentamycin bei 18 ° C im Dunkeln 8.

6. Site-spezifische Fluoreszenzmarkierung

  1. Vor der Messung inkubieren Oozyten für 45 min in Ladepuffer (110 mM NaCl, 2,5 mM Natriumcitrat und 10 mM MOPS / Tris bei pH 7,4) und 45 min in post-loading-Puffer (100 mM NaCl, 1 mM CaCl 2, 5 mM BaCl 2, 5 mM NiCl 2 und 10 mM MOPS / Tris bei pH 7,4) zur Erhöhung der intrazellulären Na +-Konzentration 14.
  2. Für Fluoreszenzmessungen inkubieren Eizellen in einer post-Ladepuffer, dass 5 uM des gewünschten Fluorophor [ex enthält. Tetramethylrhodamin-6-Maleimid (TMRM) oder Fluorescein-5-Maleimid (FM)] für 5-10 Minuten. Nach Fluorophor Kennzeichnung, waschen Sie die Eizellen erschöpfend mit Farbstoff-frei post-loading Puffer 3.

7. Elektrophysiologie

  1. Machen Mikroelektroden, indem Borosilikat Kapillaren (1B150F-4, World Precision Instruments) unter Verwendung einer Mikropipette Puller (Modell PC-10, Narishige). Füllen Sie die Elektroden mit 3 M KCl und testen Sie den Widerstand. Der Widerstand sollte zwischen 0,5-1,5 MOhm 15 sein.
  2. Anlegen der Fluoreszenz-Mikroskop (Carl Zeiss, Axio Examiner Fluoreszenz-Mikroskop) mit einem 535DF50 Anregungsfilter, einem 565 EFLP Emissionsfilter und ein 570DRLP dichroitischen Spiegel (Omega Optical) für Cystein Scanning Experimente.
  3. Legen Sie die Eizelle in einem RC-10 Kammer (Warner Instruments) auf der Fluoreszenz-Mikroskops und schieben Sie die gefertigten Elektroden in die Eizelle. Mit einem Turbo Tec-05X-Verstärker (NPI Electronics), halten das Membranpotential auf einem konstanten Wert und messen Sie den Ionenfluss über die Membran folgende Lösung Börse oder durch Änderung des Membranpotentials. Für die gleichzeitige Fluoreszenz-Messungen, mit einem 100 W Wolfram-Lichtquelle, die Donorfluorophor und eine PIN-022A Photodiode (United Detector Technologies), um Veränderungen in der Fluoreszenz-Intensität erkannt zu erregen. Beide Verstärker und Photodiode sind Schnittstellen, über eine Digidata 1440A Datenerfassungssystem (Axon Instruments), mit einem Computer nutzen pCLAMP10 Software (Axon Instruments) für die Datenerfassung und-aufzeichnung.
  4. Für Cystein Scanning, messen die Veränderung der Fluoreszenzintensität bei stationären Strom mit Spannung Schritte, die von pCLAMP 10-Software (Molecular Devices) gesteuert werden. Abhängig von der Membran-Protein von Interesse ist die extrazelluläre Lösung zur stationären Strom zu gewährleisten.
  5. Korrelieren Veränderungen in der Fluoreszenz-Intensität zu funktionellen Messungen des Zielproteins.

8. Anisotropy Messungen und Bestimmung der Entfernung Constraints.

  1. Anisotropy Messungen sollten neben Abstandsmessungen 8 entnommen werden, um die Palette von κ 2-Werte zu berechnen. Anisotropy misst die relative Beweglichkeit des Fluorophors durch die Drehung 16. Mit Polfilter (Linos Photonics Inc.), messen die parallel und senkrecht Licht durch FM oder TMRM nach Anregung mit polarisiertem Licht an Aminosäureresten von Interesse emittiert. Die Messungen werden unter Lösung Austauschbedingungen 8 und konstante Membranpotential, um die Mobilität der Fluorophore bestimmen übernommen.
  2. Anisotropie ist gegeben durch r = (I | |-I ⊥) / (I | | + 2I ⊥), wo ich | | ist das parallel abgestrahlte Licht und I ist die senkrechte Licht 16 emittiert. Um den Fehler in Abstandsmessungen berechnet, κ 2 max = 3.2 (1 + F rd + F ra + 3F rd * F ra) und κ 2 min = 3.2 (1 - (F + F rd ra) / 2 ), wo F rd = (r d / r o) 0,5 und F ra = (r a / r o) 0,5; r a Anisotropie TMRM ist r d Anisotropie von FM, und r o ist von grundlegender Bedeutung Anisotropie der einzelnen Fluorophor 8 .
  3. Zur Messung Abstandseinschränkungen, verwenden Sie ein Holoenzym die zwei zugänglichen extrazelluläre Cystein Rückstand hatWerte. Da die Eizellen mit einer konstanten Membranpotentials und somit konstanten Abstand während der Messungen stattfinden wird, hat es nicht nötig, ein Fluoreszenz-Änderung als Funktion der Konformation des Proteins werden. Inkubieren Sie die Eizellen in post-Ladepuffer mit 1 uM FM (Acceptor) und 4 uM TMRM (Donorfluorophor) für 30 Minuten auf Eis im Dunkeln, oder nur 1 uM FM. Dies ermöglicht Messungen für Holoenzymen mit und ohne Akzeptor Fluorophor 8 beleuchtete vorgenommen werden. Anlegen des Mikroskops mit einem 475DF40 Anregungsfilter, 530DF30 Emissionsfilter und 505DRLP dichroitischen Spiegel.
  4. Messen Sie die Zeit der Abhängigkeit von Spender-Bleaching in der Gegenwart und Abwesenheit des Akzeptors Fluorophor. Während der Zeit Zuge dieser Messungen sollte Lösung fließen kontinuierlich sein. Andernfalls kann ein Wärme-induzierter Fluoreszenz Erhöhung im Laufe der Zeit beobachtet werden. Der Unterschied in Photozerstörung mit und ohne Akzeptor Fluorophor wird verwendet, um den Abstand zwischen den beiden Reste zu berechnen. Holoenzymen, die nur die Donorfluorophor wird eine schnellere Photozerstörung Rate als Holoenzymen mit einem Akzeptor Fluorophor Erfahrung. Holoyenzymes, die sowohl eine Donor-und Akzeptor Fluorophor ausstellen langsam Photozerstörung Raten, wenn in unmittelbarer Nähe zueinander 8.
  5. Mit dem CLAMPEX Funktion in pClamp10, die Ergebnisse der Photozerstörung von Donorfluorophor für ein Minimum von vier Eizelle Aufnahmen Durchschnitt.
  6. Sobald die Ergebnisse gemittelt worden, verwenden Sie eine exponentielle Funktion (monoexponentielle, biexponentielle), um eine Kurve der besten Passform zu erhalten. Die Kurve der Best-Fit kann die Zeitkonstante für den Photozerstörung von Donorfluorophor mit und ohne Akzeptor zu bestimmen.
  7. Bestimmen Sie die Effizienz der Energieübertragung durch die Gleichung E = 1-Γ DA / Γ D 17, wo GDA bezieht sich auf die Zeitkonstante für die Donor / Akzeptor-Fluorophor-Paar und Γ D bezieht sich auf die Zeit konstant nur die Donorfluorophor.
  8. Mit dem Förster equation17, E = 1 / (1 ​​+ R 6 / R o 6), der Abstand zwischen markierten Cysteinreste ermittelt werden kann; E ist die FRET-Effizienz, R ist der Abstand zwischen Donor und Akzeptor Fluorophor und R o ist die 50% Wirkungsgrad Abstand für den Donor-und Akzeptor Kopplung 17. R o ist durch die Gleichung bestimmt R o = (9.7x10 3D n -4 κ 2), wobei J ist die normierte spektrale Überlappung von Donor-Emissions-und Akzeptor-Absorption, Φ D ist die Quantenausbeute der Donor-Emission ohne einen Akzeptor Fluorophor, n ist der Brechungsindex und κ 2 ist die Orientierung Faktor für Dipol-Dipol-Wechselwirkungen 8.

9. Relative Bewegung von Protein-Untereinheiten

  1. Verwenden Sie doppelte Cystein-Konstrukte, die mit Akzeptor und Donor Fluorophoren markiert sind. Für diese Experimente wird die Änderung des Abstands zwischen den beiden Cysteinreste gemessen werden. Da dies der Fall ist, sollte die Fluoreszenz-Intensität folgende Kennzeichnung auf jeder Rest unabhängig von der Konformation des Proteins 8. So wird jede Änderung in der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer das Ergebnis einer Änderung des Abstandes zwischen Donor und Akzeptor Fluorophore werden.
  2. Anlegen des Mikroskops mit einem 475AF40 Anregungsfilter, 595AF60 Emissionsfilter und 505DRLP dichroitischen Spiegel. Für diese Experimente wird der Spender angeregt und die Fluoreszenz des Akzeptors Fluorophor wird gemessen. Verwenden Sie die geeignete Methode (Spannung, Liganden, Lösung exchange), um das Membranprotein zu aktivieren und gleichzeitig messen die Veränderung der Fluoreszenz-Intensität. Eine Erhöhung der Fluoreszenz-Intensität an, dass die beiden Fluorophore und damit zwei Rückstände rücken näher zusammen. Eine Abnahme der Fluoreszenz-Intensität an, dass die beiden Fluorophore und damit zwei Rückstände sind weitere Bewegung auseinander. Schließlich wird keine Änderung in der Fluoreszenz-Intensität zeigen, dass die beiden Fluorophore und damit zwei Rückstände in der gleichen Entfernung auf die Veränderung der Konformation des Proteins sind.

10. Repräsentative Ergebnisse

Labeling extrazelluläre Cystein-Reste mit spezifischen Fluorophore ermöglicht die Untersuchung der Bewegung von Membranproteinen auf Konformationsänderungen. Ein typisches Voltage-Clamp-Fluorometrie Spur ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Veränderung der Fluoreszenz-Intensität (untere Kurve), die die Bewegung des Fluorophors aus einer hydrophilen und hydrophoben mehr Umwelt oder aus einer mehr Wasser Abschrecken auf weniger Wasser Abschrecken Umwelt ist, ergibt sich aus einer Konformationsänderung im Protein auf Lösung auszutauschen (obere trace).

Diese Technik kann exten werdended zu Einschränkungen bei den beiden Reste zu bestimmen. Solche experimentellen Ergebnisse sind in Abbildung 2 dargestellt. In Anwesenheit von einem Akzeptor Fluorophor (rot), tritt Bleichen in einem langsameren Tempo als ohne Akzeptor Fluorophor (schwarz). Die Rate der Bleichen ist direkt mit dem Abstand zwischen zwei Fluorophoren nach dem Förster Gleichung 17 zusammen. Solche Ergebnisse können auf unterschiedliche Konformationen des Proteins korreliert werden, die durch zwei Elektroden Voltage-Clamp-Experimente im Tandem durchgeführt verifiziert.

Abbildung 1
Abbildung 1. Representative Aufzeichnung der Ionentransport und Veränderungen in der Fluoreszenz-Intensität. Top, aktuelle Clamp-Messungen in Gegenwart von Na +-Test-Lösung und K +-Test-Lösung in Gegenwart von 10 uM und 10 mM Ouabain. Unten, Änderungen in florescence Intensität im Tandem mit Stromzange Messungen 3,8,19 gemessen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Zeitabhängigkeit Photobleaching. Donor Photozerstörung in Abwesenheit (schwarz) und Anwesenheit von Akzeptor Fluorophor (rot) gemessen. Jede Spur ist der Mittelwert von 4 Eizelle Aufnahmen.

Discussion

Der experimentelle Ansatz, den wir beschreiben, kombiniert ortsspezifische Fluorophor Kennzeichnung und zwei Elektroden Voltage-Clamp, um die Beziehung zwischen Struktur und Funktion von Membranproteinen zu untersuchen. Diese Technik kann verwendet werden, um zeitaufgelöste Informationen über die konformative Dynamik von Membranproteinen während Ionentransport zu erhalten. Darüber hinaus kann dieser Ansatz zugeschnitten, mit verschiedenen Proteinen wie Ionenpumpen, Ionenkanäle und Transporter zu arbeiten.

Neben der Untersuchung der konformativen Dynamik zu einem bestimmten Rest, ist es auch möglich, Fluorescence Resonance Energy Transfer verwenden, um Abstand Einschränkungen innerhalb eines Holoenzym zu bestimmen. Die Bestimmung der Entfernungen zwischen den Resten sowie die Messung der relativen Bewegung zwischen Untereinheiten können zur Lösung Kernfragen mit Gating-Mechanismen.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100W Tungsten Light Source Carl Zeiss, Inc.
1B150F-4 World Precision Instruments, Inc.
3.0-4.0 Ethicon Vicryl Johnson & Johnson
475AF40 excitation filter Omega Optical
505DRLP dichroic mirror Omega Optical
Macherey-Nagel Omega Optical
535DF50 excitation filter Omega Optical
560DRLP dichroic mirror Omega Optical
565ALP emission filter Omega Optical
565EFLP emission filter Omega Optical
570DRLP dichroic mirror Omega Optical
Linos Phtonics Inc. Omega Optical
Axio Examiner Fluorescence Microscope Carl Zeiss, Inc.
Warner Instruments Life Technologies
Digidata 1440A data acquisition system Axon Instruments
Dpn I New England Biolabs
fluorescein-5-maleimide Invitrogen
High-Pure PCR Extraction Kit Roche Group
mMessage mMachine Kit Ambion
MS-222 Sigma-Aldrich
Nucleospin Plasmid Kit Macherey-Nagel
Nanodrop 2000c Sprectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc.
PC-10 Micropipette Puller Narishige International
pCLAMP 10 Software Axon Instruments
PfuTurbo DNA Polymerase Stratagene, Agilent Technologies
PIN-022A Photodiode United Detector Technologies
Polarized Filters Linos Phtonics Inc.
QuickChange Site-Directed Mutagenisis Kit Stratagene, Agilent Technologies
RC-10 Fluorescence Chamber Warner Instruments
tetramethylrhodamine-6-maleimide Invitrogen
TOP10 Electrocompetent Cells Invitrogen
Turbo Tec-05X amplifier npi electronic

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References

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