Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

קוונפיקציה של קואנזים A בתאים ורקמות

Published: September 27, 2019 doi: 10.3791/60182
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Infectious Diseases, St. Jude Children's Research Hospital

Summary

שיטה זו מתארת הכנה לדוגמא מתאים מתורבתים ומרקמות בעלי חיים, מיצוי והלקות של הקוקוקון A בדגימות, ואחריו כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה לטיהור וכימות של קומית הלגלתית A על ידי ספיגה או גילוי של קרינה פלואורסצנטית.

Abstract

המחקר המתעוררים חשף כי הספק הסלולר (CoA) האספקה יכול להיות מגביל עם השפעה מזיקה על צמיחה, חילוף החומרים והישרדות. מדידת תעודת המקוריות הסלולרית היא אתגר בשל השפע הנמוך יחסית וההמרה הדינמית של תעודת המקוריות לתעודת המקוריות, אשר בתורו, משתתפות בתגובות מטבוליות רבות. שיטה מתוארת כי מנווט באמצעות מלכודות פוטנציאליות במהלך הכנת המדגם כדי להניב בדיקות עם טווח ליניארי רחב של זיהוי המתאים לשימוש במעבדות ביו-רפואיים רבים.

Introduction

Co A (CoA) הוא קופקטור חיוני בכל האורגניזמים החיים, והוא מסונתז מחומצה פנטותימית, המכונה גם פנטוידאט (מלח החומצה הפנטותית) או ויטמין B5. CoA הוא המוביל התאיים העיקרי של חומצות אורגניות, כולל חומצות שרשרת קצרות כגון אצטט ו סוזיטה, הענף חומצות שרשרת כגון propionate ו מתילמאלonate, חומצות שומן ארוכות כגון palmitate והרדוף, חומצות שומן מאוד ארוך שרשרת כגון חומצות שומן בלתי רוויות, ו xenobiotics כגון חומצה ולפרואית. החומצה האורגנית יוצרת הצמדה מבחינה דקדוקית באמצעות CoA כדי לאפשר את השימוש בה כמצע ביותר מ 100 תגובות בחילוף החומרים1. תעודת המקוריות הן גם מחוקקים אלוסטרוקים ומפעילים מפעילי הרכב. כעת מוערך2 כי הספק תעודת המקוריות של הסלולר מוסדר3,4; לפיכך, ניתן להגביל את זמינות ה-CoA ושליקויים בתעודת המקוריות עלולים להיות קטסטרופליים, כפי שניתן למשל בהפרעות גנטיות שעברו בירושה, המשפיעים על תעודת המקוריות של CoA5. פנטופיפיאט קינאז מזרז את הצעד הראשון בביוסינתזה של CoA (איור 1) ופנטופיפיאט קינאז, שנקרא pkan, נגרמת על ידי מוטציות ב- PANK2 gene6. CoA סינתאז, מקודד על ידי הגן Coasyn , מזרז את שני השלבים האחרונים בביוסינתזה CoA (איור 1) ו Coasy חלבון הקשורים נוירוניוון, נקרא copan, נגרמת על ידי מוטציה ב- coasyn גן7. הן PKAN ו CoPAN עוברות בירושה מחלות ניווניות הקשורים הצטברות ברזל במוח וליקויים CoA באופן בלתי מידי הפתווגיות המחלה.

רמות הסלולר של תעודת המקוריות משתנות בין הרקמות8 והמקוריות הכוללות יכולות להגדיל או להצטמצם תחת מגוון של מצבים פיזיולוגיים, פתולוגיים ופרמקלוגיים. תעודת הכבד מגדילה במהלך מיתוג הדלק מתוך הפדרלילמצבהבית, ורמות coa של הכבד גבוהות באופן חריג בעכברים שמנים לפטין לקויה10. תעודת הכבד מקטינה בתגובה בליעה אתנול כרונית11. רמות CoA של המוח במודל העכבר Pank2 מדוכאים במהלך תקופת הזמן הקצוב, אך מאוחר יותר בתוכן תעודת המקוריות של המוח בשלב מבוגר מקבילה לרמות מסוג פראי, המציינות תגובת CoA מסתגלת במהלך הפיתוח12. מניפולציה של תוכן תעודת הרקמה על ידי טרנסגנזה או שיטות משלוח גנטי משפיע על פונקציות מטבולית ועצביים13,14,15. פיתוח טרום קליני של טיפולים פוטנציאליים pkan או copan כולל תא או מדידות תעודת הרקמה כאינדיקטורים של יעילות16,17,18,19,20 . הערכה של כל התנאים הללו וההשלכות המטבולית או הפונקציונליות שלהם מחייבת שיטה כמותית למדידה של תעודת המקוריות הכוללת.

שיטת מדידה מדויקת ואמינה למדידת תעודת מקוריות בדגימות ביולוגיות היא אתגר טכני במעבדות רבות. למרבה הצער, אין בדיקה זמינים כדי להעריך או לכמת CoA או CoA thioesters בתאים שלמים, למרות האנלוגיות של תעודת מקוריות הטבע השתמשו באופן נרחב כמו בבדיקות מכניסטיות במחקרים של אסתר מקוריות ניצול אנזימים21. ההמרה של תעודת המקוריות, עם הmoiety הסולפקסיל (-SH) ללא תשלום, לתעודת המקוריות (או להיפך) מהירה בתאים או ברקמות בעלי חיים במהלך העברה לסביבה שונה ובמהלך הפירוק התאים. מספר רב של מערכות הפעלה של acyl-CoA ו-acyl-CoA מוחק בתאים מתווך בין המרות בתוך בריכת ה-CoA, ואנזימים נוספים המשתמשים בתעודת המקוריות בחומרים מעורבבים נשארים פעילים בדגימות ביולוגיות עד לאחר התניית על ידי כימיה או פיזית אומר. מחוץ לטעינה של acyl-קבוצות מתוך CoA ל קרניטין על ידי העברת התקן הוא דוגמה אחת בתוך רשת של תגובות שיכולות לשנות את התפלגות תעודת המקוריות/coa. ניתן להשתמש במשדרים רדיואקטיביים כדי למדוד שיעורי סינתזה של CoA בתאים. שיטות נוכחיות למדידת נגזרות CoA ו-CoA בדגימות ביולוגיות נבדקו22 וכוללות מצמידים spectrophotometric מגמטיים, כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה ופרוצדורות מבוססות-ספקטרומטר מסה. עם זאת, שיטות אלה מתמקדות לרוב במינים מולקולריים מסוימים של CoA ועיוורים לווריאציה של בריכת ה-CoA הכוללת. מצמידים אנזימטיים באופן כללי דורשים כמויות גדולות יותר של חומר קלט בשל רגישויות לזיהוי נמוך ויש להם מגוון מוגבל של יניאריות.

המעבדה שלנו פיתחה הליך אמין לקוונפיקציה של תעודת מקוריות בתאים מתורבתים ורקמות בעלי חיים. האסטרטגיה כוללת הידרוליזה של כל תעודת המקוריות כדי להניב רק תעודת מקוריות במהלך הכנת המדגם, במקום לבצע מאמצים לשמור ולנתח את כל הספקטרום של מינים CoA. ההליך הוא אוסף של שיטות שפורסמו בנפרד לקראת הכנה לדוגמא, תעודת זהות, טיהור וזיהוי בעקבות כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (בדיקות), וכימות של תעודת המקוריות על ידי ספיגת המידע או זיהוי של קרינה פלואורסצנטית23,24,25. דטרמינציות ה-CoA המתקבלות באמצעות הליך זה אפשרו את הבנתנו את רגולציה של תעודת המקוריות ואת פיתוח הגישה הטיפולית לטיפול בליקויים בתעודת המקוריות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

נוהל בעלי החיים המכונה בפרוטוקול זה בוצע על פי פרוטוקולים 323 ו 556 ואישר במפורש על ידי בית החולים סנט ג'וד מחקר לילדים ועדת השימוש בעלי חיים מוסדיים.

1. הכנת פתרונות

הערה: השתמש במים אולטרה-טהורים עבור כל הפתרונות וכאשר נקבע בהליכים.

  1. הכינו 1 מ"מ אשלגן הידרוקסיד (KOH) במים.
  2. להכין 0.25 M KOH במים.
  3. להכין 1 M טריזמה-HCl במים ולהתאים ל-pH 8.0.
  4. להכין 100 mM מונורומואובאיאן (mBBr) ב acetonitrile (אופטימה כיתה). פתרונות מניות של mBBr הם יציבים ב-20 ° c במשך חודשים רבים בתנאי שהם נשמרים בחושך כמו חשיפה לאור יכול photolyze המונרומביאן כדי בלטן26.
  5. הכנת מאגר כביסה עבור מיצוי השלב המלא (SPE): 50% מתנול (אופטימה כיתה) + 2% חומצה אצטית.
  6. הכן מאגר הימנעות עבור עמודת SPE: 95% אתנול (כיתה) המכילה 50 מילימטר אמוניום.

2. הכנת תקן תעודת CoA-בימרו

  1. רכוש תקן CoA באיכות גבוהה ממקור בעל מוניטין (למשל, אוואנטי שומנים קוטביים, Inc.).
  2. הכנת פתרון מלאי ריכוז גבוה של CoA ב 20 מ"מ טריס, pH 8. כמות תעודת המקוריות במלאי הריכוז הגבוה נקבעת או אושרה על-ידי spectrophotometric בינס ב-λ 260 nm (Ɛ = 16,800 M-1∙ ס"מ-1). הוסף את העודף הטוחנת של 4 מב2 של mBBr; ערבולת. בגובה של 10 ס מ לדוגמה, ל-CoA של 10 מ"מ במאגר, הוסף 40 mM mBBr. ה-mBBr נוסף לעודף כדי להבטיח שכל תעודת המקוריות תהיה ללעג.
  3. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 4 שעות בחושך בלי לרעוד כדי לדון את תעודת המקוריות עם mBBr. mbbr מגיב עם הקבוצה תיול של תעודת המקוריות, והוא הטמפרטורה התלויה ב-pH ו-27. תוספת של mBBr ממיר את תעודת המקוריות לפלורסנט מסיסים במים (או לספיגה אולטרה סגולה) CoA-בימרו (CoA-בימרו; איור 2).
  4. הוסף 100 μL חומצה אצטית ומערבולת על גבוה עבור 10 s כדי לעצור את התגובה.
  5. צנטריפוגה ב 2,000 x g עבור 15 דקות כדי להסיר את כל הזרז.
  6. נקה את הסופרנטנט באמצעות עמודת ה-SPE כדי להסיר את ה-mBBr שאינו מגיב (המתואר להלן). הסינון והצנטריפוגה של האלוטה אינו נחוץ לאחר ניקוי העמודה SPE (סעיף 5.8).
  7. אסוף את החומק מעמודת ה-SPE המכילה את ה-CoA-בימרו בצינור טרום שקילה, יבש תחת גז חנקן, לשקול ולבנות עקומת כיול סטנדרטית עם כמויות ידועות של CoA-בימרו.
    1. בדוק את תקן ה-CoA-בימרו לטוהר באמצעות האבחון (ראה להלן) עם זיהוי ספיגת בשני λ 260 (adenine moiety) ו λ 393 (בליטות moiety) וצירופי מקרים של שתי הפסגות ב כרומאטוגרם.
    2. לאשר את כמות התקן CoA-בימרו במלאי ריכוז גבוה באמצעות λ 260 nm (Ɛ = 16,800 M-1∙ ס"מ-1).
  8. רשום את זמן ההחזקה לזיהוי תעודת הזהות של CoA-בימרו בדגימות נסיוניות באמצעות התקן CoA-בימרו.
  9. אחסון מלאי הריכוז הגבוה של תקן ה-CoA-בימל מוגן מפני אור ומאוחסן ב-20 ° c עד 2 שנים. . הימנע מלהפשיר ולקפוא מחדש

3. הוצאה והוצאת תעודת מקוריות בתאים מתורבתים

  1. הקציר תאים מחסיד בתרבות כאשר מתקרבים צפיפויות subconfluent מאוחר. לדוגמה, התאים האנושיים HepG2/C3A גדלים לצפיפות של 6-8 x 106, או Hek 293t תאים גדלים לצפיפות של ~ 1.3 x 107 לכל 100 מ"מ מנה.
    1. השתמש בתרביות כפולות או טרילקאט באופן שגרתי עבור דטרמינציות CoA. מודטה מנות תרבות נפרדות במקביל לתרביות תאים לדוגמה כדי לקבוע מספר תא בר קיימא. חשב את כמות ה-CoA ל-106-10 תאים לאחר הכשלי טיהור.
  2. . מוריד את מדיום התרבות ממנה במהירות לשטוף את התאים על הצלחת עם הקרח קר פוספט מלוחים מאגור (PBS) כדי להסיר את כל המדיום שרידי ומכה את הPBS את הצלחת. במהירות לשטוף את התאים עם מים קרים קרח כדי להסיר PBS שיורית ולהשקות את המים ממנה במהירות. הימנעו מהפרעה לתאים החסיד בעת הוספת ה-PBS או המים.
  3. הוסיפו 1 מ ל של מים קרים בקרח לצלחת התרבות. לגרד תאים לתוך המים הקרים בצלחת ולהעביר את ההשעיה התא לצינור בדיקת זכוכית המכילה 400 μL של 0.25 M KOH ו 1.5 mL של מים.
    1. לערבב את ההשעיה במרץ על ידי מערבולת על גבוה עבור 10 s. ואז לכסות היטב עם הסרט פרפין ו דגירה ב 55 ° c עבור 1 h בלי לרעוד באמבט מים. ה-pH של המדגם צריך להיות ≥ 12. PH גבוהה חשוב הhydrolyze תעודת המקוריות והוא יכול להיות מותאם עם הרבה יותר מאשר בתוספת של KOH במידת הצורך.
  4. תאים הקציר תרבותי גדל ההשעיה על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה: 136 x g עבור 6 דקות ב 4 ° c. שטוף פעם אחת עם הקרח קר PBS, ואז לשטוף בקצרה שוב עם מים קרים, ולבסוף להשעות מחדש 2.5 mL של מים קרים פלוס 400 μL 0.25 M KOH. מערבבים במרץ ו-דגירה ב 55 ° צ' כפי שמתואר לעיל.
  5. הוסף 160 μL של 1 M טריזמה-HCl ו 10 μL של 100 mM mBBr ו מערבבים על ידי מערבולת על גבוה עבור 10 s. זה מביא את ה-pH כ 8 כדי לתמוך בתגובת mBBr עם CoA חינם. לכסות ולטשטש דגימות בטמפרטורת החדר עבור 2 h בחושך עבור mbbr להגיב עם תיול של תעודת המקוריות.
  6. הוסף 100 μL של חומצה אצטית לערבב על ידי מערבולת על גבוה עבור 10 s כדי לעצור את התגובה
  7. צנטריפוגה ב 2,000 x g עבור 15 דקות כדי להסיר שרידים של תאים זירז.
  8. הסר ושמור supernatant במבחנה זכוכית לניקוי העמודה SPE המתואר להלן.

4. הוצאה והוצאת תעודת מקוריות ברקמות

  1. לנתח את החלקים רקמת החיות, כ 0.5 ס"מ קוטר או קטן יותר, ו למחוק בקצרה (1-2 s) על נייר סופג ולאחר מכן הקפאת הקפאה בחנקן נוזלי ולאחסן ב-80 ° צ' עד העיבוד. תעודת מקוריות ברקמות היא הידרוליזה או המרה ל-thioester אם לא הבזק קפוא. שלב זה חשוב לקבל את התשואה המירבית של תעודת המקוריות ברקמות.
  2. שוקלים חתיכות רקמה קפואה (5 – 60 mg) במהירות לפני תחילת הניתוח, ולהקליט את המשקל עבור כל מדגם. הגדרה זו של משקל רטוב משמשת לחישוב תוכן ה-CoA בעקבות טיהור השימוש באמצעות המאמר. להימנע מוחלטת ההפשרה של חתיכות הרקמה.
  3. הוסף 2 מ מ של 1 מ"מ KOH לצינור בדיקת זכוכית (g., 13 מ"מ x 100 מ"מ חד פעמי) המיועד להוספה של שיבוש בדיקה ורקמות עם הומוגניצר רוטור. . תשאיר את השפופרת על הקרח עד השימוש הדבר נעשה על מנת להבטיח שדגימות הומוגניים בטמפרטורה קרה ותעודת המקוריות לא תיהרס בשל החום שנוצר במהלך הומוגון.
  4. העברה והומומטר רקמות (30 – 40 mg) בצינור בדיקת זכוכית (המכיל קר 1 mM KOH) עבור 30 s. להימנע להשלים את החלקה של הרקמה.
  5. הוסף 500 μL של 0.25 M KOH; ומערבולת על גבוה 10 s ולשמור על הקרח עד כל הדגימות הם הומוגניים. זה יביא את ה-pH של המדגם מעל 12 כדי hydrolyze תעודת המקוריות כדי להניב תעודת מקוריות (CoA חינם והידרוליזה תעודת מקוריות).
  6. מודטה דגימות ב 55 ° c עבור 2 h באמבט מים מבלי לרעוד כדי לתמוך הידרוליזה.
  7. הוסף 150 μL של 1 M טריזמה-HCl ו 10 μL של 100 mM mBBr; ערבולת בגובה של 10 שניות זה מביא את ה-pH כדי 8 כדי לתמוך בתגובת mBBr עם תעודת מקוריות בחינם.
  8. מודטה דגימות בטמפרטורת החדר עבור 2 בחושך כדי להבטיח את כל תעודת המקוריות הוא ללעג עם mBBr.
  9. הוסף 100 μL של חומצה אצטית ומערבולת על גבוה עבור 10 s כדי לעצור את התגובה.
  10. צנטריפוגה ב 2,000 x g עבור 15 דקות כדי גלולה גרם להריסות התאים.
  11. הסר ושמור supernatant במבחנה זכוכית לניקוי העמודה SPE (המתואר להלן).

5. דגימת נקיון עם עמודת מיצוי הפאזה (SPE)

  1. בטמפרטורת החדר, משקל כל חד פעמי 2-(2-pyridyl)-אתיל סיליקה ג'ל עמודה (1 mL גודל) עם 1 mL של מאגר לשטוף כדי להבטיח כי הקבוצה הפונקציונלית pyridyl הוא protonated ו יפעל כמו anion מחליף. 2-(2-pyridyl)-אתיל סיליקה ג'ל הוא מחליף חלש האניב שהוא אידיאלי עבור CoA-בימרו ב pH בסיסי. 2-(2-pyridyl)-אתיל סיליקה ג'ל יש pKa של 6 ו משחררזציה נעשה pH ≥ 7.
  2. הוסף לדוגמה supernatant (שלב 4.11) לטור ולאסוף משחרלי.
  3. שטוף את העמודה פעמיים עם 1 מ ל של שטיפת מאגר כדי להסיר כל מינים שלא נשמרו.
  4. שטוף עמודה פעם אחת עם 1 מ ל של מים.
  5. לשטוף את הטור פעמיים עם 1 מ ל של מאגר האלוטור לתוך צינור בדיקת זכוכית נפרדת (12 מ"מ x 75 מ"מ) כדי לאסוף את תעודת המקוריות-בימרו.
  6. בדיקת תעודת המקוריות בתוך הצינור מתחת לגז חנקן עד יובש. המדגם היבש יציב בטמפרטורת החדר עד לשימוש נוסף. לאטום ולכסות לחלוטין את הצינור ואת החנות.
  7. כאשר מוכן לניתוח האנליזה, להשעות מחדש את המדגם 300 μL של מים ומערבבים במרץ על ידי מערבולת על גבוה עבור 10 s.
  8. העברת דגימה מחדש למסנן צנטריפוגה שפופרת (0.22 יקרומטר תאית אצטט, 2 mL גודל) ו צנטריפוגה ב 5,000 x g עבור 10 דקות כדי להסיר את כל הזרז.
  9. העבר דגימה מסוננת לבקבוקון זכוכית המתאים להזרקה.

6. היקף הטיהור והמדידה של CoA-בימרו

  1. . הכן מאגרים מאגר A: 50 mM KH2PO4, pH 4.6; מאגר ב: בעלי משקל (אופטימה כיתה).
  2. הכוח את מערכת המערכת.
    הערה: מערכת המבחנות במעבדה שלנו היא ווטרס e2695 הפרדות מודול מצויד 2489 אולטרה סגול-גלוי (UV-Vis) בספיגת גלאי ו 2475 מזהה פלואורסצנטית נשלט עם העצמת 3 תוכנה. במערכת יש גם מזרק אוטומטי לדוגמה.
  3. להזריק כל מדגם (למשל, 20 μl) עבור הפרדה על סי18 תאומים, 3 יקרומטר 100 Å, 4.6 mm x 150 mm עמודה באמצעות התוכנית בטבלה 1 עם קצב זרימה של 0.5 mL/min. טמפרטורת הטור היא 25 ° c. מדוד את ספיגת גלאי UV/גלוי ב λ 393 nm, וזיהוי פלורסנט ב λex = 393 nm, λem = 470 nm. זמן השמירה נקבע על-ידי הפעלת עקומה סטנדרטית של CoA-בימרו לפני כל ערכת דגימות.
  4. הקלט את האזור תחת השיא של תעודת המקוריות של CoA-בימל לכל דוגמה, והשווה עם העקומה הסטנדרטית לחישוב pmol של CoA-בימרו על העמודה ' בדיקת המידע '. העיקול הרגיל של מבנה תעודת המקוריות משמש לדגימות רקמה, והעקומה הסטנדרטית של CoA-בימרו משמשת לדגימות של תרבות הרקמה.
  5. כאשר ערכי תעודת המקוריות מייצגים את תעודת המקוריות הכוללת עבור כל דוגמה, מנרמל את מספר התאים הפעילים עבור דגימות התרבות, או mg משקל רטוב עבור דגימות רקמה (איור 6). לחלופין, חשב את ערכי ה-CoA הכוללת לאחר נורמליזציה ל-DNA או לתוכן חלבונים עבור כל דוגמה. DNA או תוכן החלבון ניתן לקבוע בנפרד באמצעות מדגם ali, כי יוסרו במהלך ההכנה לדוגמה לפני בנוסף KOH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיטה מהירה ואמינה יחסית לאיתור תעודת המקוריות הכוללת בתאים וברקמות שפותחו על-ידי השימוש בשיטת ה-coa לסוכן פלורסנט באמצעות mBBr, ולאחר מכן מטהרת את תעודת הזהות של תעודת הזהות באמצעות היפוך הפאזה. עקומה סטנדרטית נוצרת לראשונה, כאשר הכמויות הידועות והגדלות של תקן ה-CoA-בימרו מוזרקים בנפרד והאזורים שמתחת לפסגות ב-CoA-בימרו כרומטוגרמות מותווים כפונקציה של תעודת המקוריות-בימרו (איור 4). תעודת המקוריות של CoA-בימרו מרבית ב-λ 393 nM ובפרופיל המערכת מציגה את זמן ההחזקה של תקן תעודת המקוריות בסי18 (איור 3) באמצעות התוכנית החומקת בטבלה 1. מייצגים סטנדרטיים של תעודת מקוריות של CoA-בימרו, שזוהו על ידי מדידת הספיגה או יחידות הזריחה, מוצגים באיור 4א ואיור 4ב, בהתאמה. העקומה הסטנדרטית באיור 4A משקפת את גודל הספיגה של תעודת המקוריות ב-λ 393 nm ואיור 4ב מייצגת את הזריחה של תעודת המקוריות (λex = 393 nm ו λem = 470 nm) המותוות לעומת כמות הקלט של . תעודת המקוריות התקן תעודת המקוריות (CoA-בימרו) ניתן לזיהוי מ-0.01 עד 12,000 מטרים ומכסה טווח של 10שישה מטריםכאשר האיתור באמצעות ספיגת הקרינה והזריחה משולבים. בעוד הגבול התחתון של גילוי של התקן הוא 0.01 pmol, הגבול התחתון של תעודת הזהות של CoA-ביקאן בדגימות ניסיוני הוא 0.2 pmol שהוא כ 5-קיפול גדול יותר מאשר בסיסית או ברקע של זריחה ב chromatogram. בחירת הזיהוי על-ידי ספיגה או זריחה של CoA-בימרו תלויה בכמות תעודת המקוריות הקיימת בדרך כלל ברקמות או בתאים, יחד עם המעשיות של עבודה עם גדלים גדולים או קטנים יותר לדוגמה. ספיגה היא בדרך כלל שימושי עבור דגימות רקמה משום טיפול 40-50 mg של התחלת חומרי התאוששות טובה יותר מאשר 5 מ ג דגימות רקמות, בעוד שהזריחה היא שימושית בדרך כלל עבור דגימות תאים מתורבת אשר קטנים בגודלם ויש יותר ביטחון באינטרפולציה של ערכים בקצה התחתון של העקומה הסטנדרטית של הזריחה. מעבדות עם זיהוי ספיגה בלבד עשויות לשקול להגדיל או להקטין את גודל המדגם, להגדיל את נפח ההזרקה של האבחון או להקטין את אמצעי האחסון עבור השעיה לדוגמה (סעיף 5.9 לעיל) למדידות בתאים מתורבתים.

התנאים עבור הידרוליזינג acyl-Coa של רקמות ותאים מתורבתים היו ממוטבים על ידי התאמת הריכוז KOH, ואת הזמן ואת הטמפרטורה של הדגירה הבאה (נתונים לא מוצגים). המצב האופטימלי נמצא 0.25 M ב 55 ° צ' עבור 2 שעות. קבוצת תיול של תעודת המקוריות בחינם ותעודת המקוריות המשוחררת מהאיואסטרים היו ללעג על ידי תגובה עם mbbr ההתאמה הבאה של ה-pH. הפרדת ופרופילי זיהוי טיפוסיים לכבד העכבר או התאים האנושיים C3A מצוינים באיור 5 כפסגות אדומות, עם זמן שמירה בין 11 ל-12 דקות באמצעות תוכנית הימנעות המתוארת בטבלה 1. כמויות טיפוסיות של חומר התחלתי ביולוגי הם 30-40 מ"ג של הכבד murine (משקל רטוב), 6-8 x 106 תאים עבור האדם" כבד כמו "תאים C3A, או ~ 1.3 x 107 תאים עבור תאים אנושיים HEK293T. התאים C3A טופלו PanK התרופה PANK ניסיוני-2891 ב 10 uM אשר מרוממת CoA17 (איור 6). מדידות ה-CoA בתאי HEK293T כאשר PanK מבוטאים להציג מדידות CoA על פני מגוון רחב (431-6925 pank/μL) (איור 6). גדלי המדגם הנדרשים למתודולוגיה זו מעשיים ליישום להקשרים ניסיוניים רבים.

האזור שמתחת לשיא תעודת המקוריות היה מחושב באמצעות תוכנה שסופקה באמצעות היישום. מגבלות שיא ניתן לקבוע באופן אוטומטי על ידי תוכנת הטיפול בדיקות התאמה נאותה של ערכי קלט עבור תיקון בסיסי והגדרת שיא, אבל המעבדה שלנו מעדיף לייעד באופן ידני את פסגת CoA-בימרו בכל כרומטוגרם, במיוחד לדגימות ביולוגיות לא מוכרות.

זמן (מזערי) קצב זרימה (mL/min) % A % B עקומה
0 0.5 90 10 0
2 0.5 90 10 6
6 0.5 85 15 6
18 0.5 60 40 6
23 0.5 60 40 6
25 0.5 90 10 6
30 0.5 90 10 66

שולחן 1: תוכנית לה, הפרדת תעודת מקוריות. מאגר A: 50 mM KH2PO4, pH 4.6; מאגר ב:. ערבוב של מאגר A ו-מאגר B כדלקמן עקומה 6 אשר הוא מעבר ליניארי, עם עקומת מתערבת 8 שהוא מעבר שיפוע בינוני.

Figure 1
איור 1. Co מסלול יוסינטזה. פנטופיפיאט קינאז (PanK) מזרז את הזרחון של פנטופיאט (ויטמין B5) ל -4 ′-פוספופאנטופיאט בשלב הראשון של הביוסינתזה של תעודת המקוריות. היווצרות של פוספופאנטוסטיאט מלווה בעיבוי ציסטאין באמצעות 4 ′-פוספופאנטותטין סינתאז ולאחר מכן פירובט לטופס 4 ′-פוספופאנטאנטין על-ידי 4 ′-פוספיוהואנטציסטטין דארגארקלז. 4 ′ פוספופאנתטין מומר לקואנזים A (CoA) בתהליך דו-שלבים המזרז של תעודת המקוריות סינתאז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. תגובת mBBr עם CoA. מונרומברוביואן (mBBr) מעורבב עם CoA-SH (CoA חינם) ומודקרת בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות בחשיכה. MBBr שאינו פלורסנט הופך לפלורסנט כאשר הוא מאוגד ל-CoA כדי ליצור תעודת CoA-בימרו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ספיגת החומרים של תעודת הזהות של CoA-בימרו. תעודת המקוריות הייתה מופרדת על-ידי מערכת ג'מיני סי18 באמצעות תוכנית הלימודים בטבלה 1. זמן שמירה אופייני (דקות) מצוין על-ידי יחידות ביטול (AU). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תעודת מקוריות (CoA)-עקומות סטנדרטיות שזוהו על ידי ספיגה או זריחה. (א) העקומה הסטנדרטית שנמדדה באמצעות יחידות זיהוי ספיגה עבור CoA-בימרו נמדדה ב-λ 393 nm. דגימות רקמות מוערכות בדרך כלל באמצעות עקומת ספיגת התקן. (ב) עקומת התקן נמדד באמצעות יחידות זיהוי של הזריחה עבור CoA-בימרו ב λex = 393 ננומטר, λem = 470 nm. תאים מתורבתים מוערכים בדרך כלל עבור תוכן CoA באמצעות העקומה הסטנדרטית של הקרינה הפלואורסצנטית. תקנים כפולים (ודוגמיות) מוערכים באופן שגרתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: בדיקות מרשמים של כבד או דגימות תאים מתורבתות. (א) תעודת זהות וקוונפיקציה של תוכן בתמצית כבד העכבר. יחידות ספיגה (AU) מצוינות. (ב) תעודת זהות וכימות תוכן בתאים HEPG2/C3A מתורבתים. יחידות פליטה של קרינה פלואורסצנטית (EU) מסומנות. פסגות תעודת המקוריות מוצגות באדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6. רמות CoA בכבד העכבר, מC3A ותאי HEK293T מתורבתים. (א) תעודת מדידה בכבד העכבר מתוך הסתרה בנוקאאוט (Pank1-/-) ומתאימים בעלי חיים בעלי סוג פראי (WT). Pank1-/- בעלי חיים יש תעודת מקוריות בכבד לעומת WT בעלי חיים עקב היעדר Pank1 expression9. הנתונים הושגו באמצעות 5 עכברים זכרים לכל גנוטיפ והם מיוצגים בתור ממוצע ± SEM. (ב) רמות CoA ב HEPG2/C3A מטופלים עם dimethylsulfoxide (שליטה ברכב) או pz-2891, תרופה ניסיונית המאופדים פעילות pz ב 10 uM 17. רמת תעודת המקוריות הסלולרית מוגבהת בעקבות דגירה של 24 שעות עם pz-2891. (ג) רמות COA ב HEK293T תאים מפוהים עם וקטור ריק pcdna 3.1, או cdnas קידוד אנושי pank isoforms: PANK1β, PANK2m שהוא בוגרת, isoforms מעובד של האדם PANK2, או PANK3. רמות CoA מוגברות על-ידי ביטוי יתר של כל ה-PANK הפעילים. הנתונים ב-(ב) ו-(ג) הם מדוגמיות של טרילקייט עצמאיות ומיוצגים כממוצע ± SEM. הניתוח הסטטיסטי נעשה באמצעות הבדיקה הבלתי משויכת וערכי המשמעות מוצגים באדום. הנתונים בחלוניות (ב) ו-(ג) מותאמים מארמה אל. 12אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנו מדגימים הליך אמין, צעד אחר צעד כדי לכמת תעודת מקוריות בתאים ורקמות בעלי חיים עם מגוון רחב של זיהוי ליניארי, כי הוא נגיש במעבדות רבות כי יש בדיקות עם ספיגת או מזהה הפלט הפלואורסצנטית. לחילופין, ספקטרומטר מסה היא טכניקה נפוצה להערכת תעודת המקוריות ותעודת המקוריות, אך אינה זמינה באופן נרחב בשל עלות המכשור והידע הדרוש לפיתוח מתודולוגיה ופרשנות של נתונים. Isotopically התווית CoA המתאימה לשימוש כתקן פנימי לקוונפיקציה של תעודת מקוריות בחינם בספקטרומטר המסה אינה זמינה מבחינה מסחרית, ותעודת מקוריות בחינם אינה מזוהה על-ידי המכשיר בעל הרגישות הזהה ל-CoA thioesters כגון אצטקסיל-CoA. לפיכך, רמות CoA חופשיות אינן מעלות באופן מזלזל על-ידי ספקטרומטר מסה, אלא אם כן נתוני הפלט מושווים עם עקומת כיול סטנדרטית של תעודת מקוריות.

השוונו את השיטה המתוארת כאן עם שיטה שונה בעבר במעבדה שלנו ומצאה שחזור CoA גדול יותר מכבד העכבר, 123.4 ± 7.9 pmol/mg משקל רטוב, עם השיטה הנוכחית לעומת ~ 80 pmol/mg משקל רטוב באמצעות שיטה אנזימטית ה תעודת מקוריות חינם עם תגית רדיואקטיבית28. השיטה למדידת תעודת מקוריות הכוללת המתוארת כאן היא פחות מסורבלת, מהירה וקלה יותר לשליטה בהשוואה לשיטה שהיתה בשימוש במעבדה שלנו28. בעבר, תעודת המקוריות הייתה נחושה לאחר חילוץ הקסאן של תא הניתוח והפיכתו להמרה אנזימטית ל רדיואקטיבי [14ג] לאוראל-coa שבתיווך הבנק הקולי של הבנק (fadd). החומצה המסיסה של חומצות השומן והחומצות הקצרות-מקוריות והחומצה הארוכת-מסיסות של השרשרת הסלולרית היתה הידרוליזה ב-KOH כדי להניב תעודת מקוריות חינם ולאחר מכן נתון לחילוץ הקסאן לפני ההמרה האנזימטית לתעודת המקוריות החופשית29. למרות שההליך הקודם הזה היה מדויק ורגישות טובה, בפועל המשימה הנדרשת 2 ימי עבודה כדי להשלים את רקומביננטי E. coli -CoA הבורסה היה צריך להיות מוכן, מטוהר ונמדד לפעילות מסוימת אנזימטית לפני ניתוח תעודת המקוריות. זה גם דרש מכשור המסוגל לזהות ולכמת איזוטופים רדיואקטיביים אשר הרבה פחות נפוצה במעבדות ביו-רפואית בהיסטוריה העדכנית יותר. השיטה הנוכחית, כמתואר כאן, מתאימה ביותר לעניין המחקר שלנו בפנטופאביק קינאז (PanK). PanK שולט שטף דרך מסלול ביוסינתטי CoA ולכן רמת CoA הכולל הוא הבדיקה עבור פעילות PanK בדגימות ביולוגיות.

קונצ'ינג של תגובות מטבוליות במדגם ביולוגי כדי לשמור על כמות אמיתית של CoA דורש טיפול מהירות והוא קריטי עבור הליך זה. המלחה מהירה עם חומצה או מממס אורגני, או הקפאת הדגימה של דגימות הן שתי שיטות ששימשו בעבר30,31. בשיטה הנוכחית, מים קר במיוחד באולטרסאונד מתווסף במהירות לתאי קרח קר PBS שטוף מתרבויות, ותאים חסיד בתוספת מים הם אז מגורד את הצלחת התרבות לפני העברת KOH. הקפאת ההשעיה התא תרבותי ב [KOH + מים] עבור אחסון ב-80 ° צ' לפני ההכנה לדוגמה היא נקודת עצירה מקובלת. עם זאת, יש להשוות ערכי CoA מדגימות תאים קפואים לאלה מדגימות טריות כדי לקבוע אם יש אובדן משמעותי של אות תעודת המקוריות. אובדן של ≤ 10% CoA התרחשה בידיים שלנו בעקבות הקפאת דגימת התא עשוי להיות קשור לזמן המורחבת של המדגם ב KOH אשר צריך להיות נשלט. חתיכות של רקמת בעלי חיים קפואים במהירות על נייר כסף ' רפסודה ' צף ב-LN2 מיד לאחר כריתה של הרקמה מבעל חיים מורדמים. לדוגמה גדלים מ 5 מ"ג ל 60 מ"ג של רקמה קפואה מתאימים לשיטה זו עם תשואות ליניארי של CoA. ברגע שקפוא, דגימות הרקמה המאוחסנות ב-80 ° c יציבות לפחות 3 חודשים, ומספקות שהפשרה לסירוגין אינה מתרחשת.

ההכנה לדוגמה לפני ניתוח האבחון אינה מהווה תפוקה גבוהה ומחייבת חצי יום עבודה מלאה. מומלץ כי המפעיל מטפל מקסימום של 30 דגימות בבת אחת, החל עם הומוגון של קבוצה של 15 דגימות ואחריו הומוגון של הסט השני של 15 דגימות במהלך הדגירה 2 h עם KOH עבור הסט הראשון. תקופת דגירה KOH היה לראשונה אופטימיזציה באמצעות תעודת מקוריות שנרכשו עם זמני דגירה החל 30 דקות עד 4 h, ואז הדגירה 2 h נבחרה כדי להתאים את הזמן עבור תעודת מקוריות הידרוליזה במגוון דגימות רקמות, החל משריר השלד לכבד8. דגירה של תעודת מקוריות עם mBBr מוגדר ב 2 h ב כ-pH 8 ו-20 קיפול עודף של mBBr נוסף כדי להמיר לחלוטין את תעודת המקוריות בדגימות הביולוגי. Sulmoieties yl של חלבונים מטבוליטים מלבד coa כגון קרניטין או גלוטתיון במדגם יהיה ללעג בנוסף coa, ואת העודפים 20 מקפלים היה מחושב על בסיס הסכום הצפוי של הכבד CoA סך אשר הרמה הגבוהה ביותר בין הרקמות. ה-pH מופחת לפני דגירה עם mbbr כי ברואובליות בכלל הם פחות מגיבים כלפי הנופילים אחרים כמו אמינים ו carboxylates בפתרונות ניטרליים יותר מימית. הזמן של ללעג לא צריך לחרוג 2 h כדי למנוע או להפחית את התגובה עם החלבון תיולים26. אדם צריך להשתמש במאגרים לא מנופילים כדי לצמצם ולתחזק את ה-pH, מכיוון שנוכחותם של מאגרי מאגר בריכוזים גבוהים עלולה להפריע ללדריזציה של תעודת המקוריות.

לדגום לנקות על העמודה SPE נעשית באופן ידני במעבדה שלנו ניתן לבצע בעזרת סעפת ואקום כדי לקצר את הזמן הנדרש עבור שלב זה. החלמה טובה של תעודת המקוריות מעמודת ה-SPE היא באופן שגרתי, והדבר נקבע בנפרד באמצעות מקוריות (13C) של תעודת המקוריות, אשר נשמרים גם בעמודת ה-SPE. השחזור של [13ג] אצטל-coa היה 97.6% ושחזור של [13ג] פלמיטאיל-coa היה 96.1%. אידוי של משחררות עמודה מבוצעת בדרך כלל תחת גז חנקן לילה במעבדה שלנו כעניין של נוחות, אבל ייבוש ניתן להשלים בתוך 4 שעות תחת גז חנקן או באמצעות מרכז speedvac. השלבים הקריטיים ביותר בשיטה קשורים להתאמת pH וניתן לבדוק אותם עם רצועות נייר pH לאורך הדרך. עבור ההידרוליזה KOH, ה-pH צריך להיות ≥ 12 כדי להשיג שחרור מלא של thioester מ-CoA. ה-pH צריך להיות 7.8 – 8.5 כדי לתמוך את הפעילות מחדש של mBBr-דבטיזציה, ולאחר השלמת ללעג, את ה-pH צריך להיות מותאם להיות חומצי מאוד, על pH 1-2, על מנת CoA-בימרו לאגד את העמודה SPE. עמודת ה-SPE מנקה את המדגם כדי למנוע מmbbr מיותרים וכמה חומרים ביולוגיים שאינם קשורים.

תוכנית הכיול מעוצבת כך שכביסה ושחזור מחדש של העמודה סי18 מספיקה כדי לסלק את הרקע והאותות בין הדגימות. דגימות מים ריקות מוכנסים לאחר כל 5 דגימות במדגם ניסיוני להגדיר כאמצעי זהירות כדי לפקח על נושא אפשרי בין סטים וכדי להבטיח ניקיון העמודה. שגיאה מזדמנים מפני הזרקה לדוגמה שגויה עלולה להתרחש כאשר משתמשים במזרקות לדוגמה אוטומטיות עבור הבדיקות, וניתן לבדוק זאת בקלות על-ידי השוואת אמצעי האחסון הנותרים בבקבוקונים לדוגמה לאחר הזרקה או בדיקה של הפסגות הלא-CoA הקשורות ב כרומטוגרם פלט. אם ערכי ה-CoA חורגים מהטווח הליניארי של עקומת הכיול לאיתור הקרינה הפלואורסצנטית, סביר להניח שהערכים יהיו בטווח עבור זיהוי ספיגת הרוויה האולטרה-סגולה. אם לא, דילול המדגם עם נפח מוכר של מים יכול להפחית את האות להיות בטווח ליניארי וחישובים צריך לקחת כל גורם דילול בחשבון.

רמות CoA ישתנו בין זנים העכבר מדומה עם רקעים גנטיים שונים, למרות הערכים הם מיוונים כאשר דגימות ביולוגיות מתקבלים מאותו זן תחת אותם תנאים. הערכנו CoA במספר קווי עכבר שונים במחקרים שונים10,12,16,17. CoA נמדד גם במספר קווי תאים מתורבתים16,17 באמצעות תאים ראשוניים או מונצח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

MWF, CS ו-SJ כתב את הנייר, MWF ו CS סיפק את הנתונים והאיורים, COR עיצב את הניסויים וביקורתית ביקורת על כתב היד. SJ ו-COR הם ממציאים על יישום פטנטים ממתינים (PCT/US17/39037) "מולקולה קטנה של מודולים של פנטסים" שנערך על ידי בית החולים סנט ג'וד ילדים מחקר המכסה את מתחם PZ-2891 מופנה במאמר זה.

Acknowledgments

המחברים מכירים במימון עבור מחקר ממומן שסופק על ידי CoA Therapeutics, Inc., חברת בת של ברידג LLC, המכונים הלאומיים להענקת מענק בריאות GM34496, ו לבנון האמריקאית הקשורים ארגוני צדקה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column Millipore-Sigma 54127-U
coenzyme A Avanti Polar Lipids 870700
Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column Phenomenex 00F-4439-E0
monobromobimane ThermoFisher Scientific M-1378
Omni-Tip probe tissue disrupter Omni International 32750H
Parafilm Fisher S37440
PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer ThermoFisher Scientific NC0530997
Spin-X centrifuge tube filter CoStar 8161
Trizma-HCl Fisher T395-1
Waters 2475 fluorescence detector Waters 2475
Waters 2489 UV-Vis detector Waters 2489
Waters e2695 separations module Waters e2695

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abiko, Y. Metabolic Pathways. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).
  2. Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S. Coenzyme A: Back in action. Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).
  3. Jackowski, S., Rock, C. O. Regulation of coenzyme A biosynthesis. Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).
  4. Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle. Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).
  5. Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration. Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).
  6. Zhou, B., et al. A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome. Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).
  7. Dusi, S., et al. Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation. American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).
  8. Dansie, L. E., et al. Physiological roles of the pantothenate kinases. Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).
  9. Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PLoS ONE. 5, 11107 (2015).
  10. Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).
  11. Israel, B. C., Smith, C. M. Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats. The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).
  12. Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism. PLoS One. 7, 40871 (2012).
  13. Corbin, D. R., et al. Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2. Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).
  14. Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).
  15. Shumar, S. A., et al. Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice. PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).
  16. Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy. Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).
  17. Sharma, L. K., et al. A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration. Nature Communications. 9, 4399 (2018).
  18. Alvarez-Cordoba, M., et al. Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation. Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).
  19. Arber, C., et al. iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease. PLoS One. 12, 0184104 (2017).
  20. Di Meo, I., et al. Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency. Scientific Reports. 7, 11260 (2017).
  21. Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications. Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).
  22. Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples. Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).
  23. Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane. Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).
  24. Shimada, K., Mitamura, K. Derivatization of Thiol-Containing Compounds. Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).
  25. Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue. Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).
  26. Newton, G. L., Fahey, R. C. Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography. Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).
  27. Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione. Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).
  28. Zhang, Y. M., et al. Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis. Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).
  29. Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues. Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).
  30. Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats. Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).
  31. Chohnan, S., Takamura, Y. A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells. Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).

Tags

ביוכימיה סוגיה 151 Co A תאים מתורבתים רקמות בעלי חיים monoרומטוזיס obimane בלחץ גבוה כרומטוגרפיה נוזלית הפקת שלב מוצק
קוונפיקציה של קואנזים A בתאים ורקמות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frank, M. W., Subramanian, C., Rock, … More

Frank, M. W., Subramanian, C., Rock, C. O., Jackowski, S. Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (151), e60182, doi:10.3791/60182 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter