ショウジョウバエ バローイングとトンネリングアッセイ:フライ幼虫の組織低酸素症を評価する方法

- 胚コレクションケージを設定するには、新鮮な酵母ペーストを加えたブドウジュース寒天プレートを使用し、適切な遺伝子型のオスとメスのショウジョウバエハエを含むケージにプレートを置きます。酵母やブドウジュースの臭いは魅力的で、メスの産卵を促進します。その後、成人を取り除き、胚プレートを24時間インキュベートして最初のインスター幼虫を得ます。 プレートを切り取り、イーストペーストで満たした。

若い幼虫は、発達するために体重を増やすために餌を与えなければならない、だから、彼らは食料源、酵母ペーストで穴を掘る。彼らが発達するにつれて、幼虫は放浪期に入り、食べ物から離れてトンネルを掘り起こして子犬の場所を探し出す。低酸素症を評価するために、基質内の幼虫の形態を調べる。

- テキストプロトコルに記載されているように、卵の皿のコントロールと実験的な遺伝的十字架を設定します。タイミング付きの卵コレクションを開始する前に少なくとも2日間暗闇の中でハエを保ちます。時間指定された卵のコレクションのために、大人を1日早くに酵母ペーストの新鮮な塗りつぶしで飾られた新しいブドウ寒天プレートに移し、大人が4時間プレートに卵を産むことを可能にします。

次に、摂氏25度で一晩4時間の回収プレートをインキュベートします。次の午後までに、幼虫のほとんどは孵化します。

アッセイを1回実行する場合は、実験グループごとに少なくとも5つのアッセイプレートを準備します。加熱して700ミリリットルの脱イオン水に16グラムのフライ寒天を加えます。 95%エタノールで17.5ミリリットルのニパジンを準備し、寒天溶液がほぼ完全に溶解するまで寒天溶液を加熱し、寒天溶液が完全に溶解するまで加熱します。

硬化した寒天は触れ合いにしっかりして崩れ落ちることに抵抗する必要があります。寒天が治ったら、1.5センチのコルクボーラーを使って各プレートの寒天ゲルの中央に穴を開け、新鮮な酵母ペーストで穴をきれいに埋めます。

幼虫をアッセイプレートに移すには、簡単な道具を作り、プラスチック製のマイクロスパチュラの先端にカーブを曲げ、酵母ペーストに先端を浸して幼虫に接着剤を貼ります。

アッセイの再現性を確保するためには、各アッセイプレートに10個の幼虫しか置かないようにすることが重要です。マイクロスパチュラ先端を持つ幼虫を送達するたびに1本の幼虫のみが移送されることを慎重に判断してください。

プレートがロードされたら、ラベルを付け、それを覆い、蓋側を室温で暗闇の中に置き、すべての幼虫が死ぬまで毎日各プレートを調べてください。アッセイの2日目から8日目までの野生型株のプレートの例はここにあります。

慎重に曲がったからかい針で子犬をブドウのプレートに移し、必要に応じて、何人の子犬の結末を数えます。