Drosophila Burrowing ve TünelLeme Tahlil: Sinek Larvalarında Doku Hipoksisini Değerlendirme Yöntemi

- Embriyo toplama kafesini kurmak için taze maya ezmesi ile desteklenmiş üzüm suyu agar tabakları kullanın ve tabakları uygun genotipte erkek ve dişi Drosophila sineklerini içeren kafeslere yerleştirin. Maya ve üzüm suyundan gelen koku çekicidir ve dişiler tarafından yumurtlamayı teşvik eder. Sonra zamanlanmış bir süre boyunca yumurtlamaya izin verin. Sonra yetişkinleri çıkarın ve embriyo plakalarını 24 saat boyunca kuluçkaya yatırarak ilk instar larvaları elde edin. Sonra üzüm suyu tabağından birkaç bireysel larvayı hafifçe, agarın ortasındaki agarda bir deliğin bulunduğu sadece bir test tabağına aktarın. tabak kesildi ve maya macunu ile dolduruldu.

Genç larvalar gelişmek için vücut ağırlığı kazanmak için beslenmelidir, bu nedenle besin kaynağına, maya macununa yuvalanırlar. Larvalar geliştikçe, yavru için bir alan aramak için yiyeceklerden uzaklaşma evresine girerler ve tünel açarlar. Hipoksiyi değerlendirmek için, alt tabakadaki tünel desenleri larva formunu incelemek. Eksik veya yetersiz tünellenme oksijensizliğinin bir işaretidir. Örnek protokolde, yuvalama ve tünel açmanın nasıl kurulacağını göreceğiz.

- Metin protokolünde açıklandığı gibi yumurta döşeme yemeklerinde kontrolü ve deneysel genetik haçları ayarlayın.. Zamanlanmış yumurta koleksiyonlarına başlamadan önce sinekleri en az iki gün karanlıkta tutun.. Süreli yumurta toplama için yetişkinleri günün erken saatlerinde taze bir maya ezmesi lekesi ile süslenmiş yeni üzüm agar tabaklarına aktarın ve yetişkinlerin dört saat boyunca tabaklara yumurta bırakmasına izin verin. Dört saat sonra yetişkinleri taze üzüm agar tabaklarına aktarın.

Daha sonra, dört saatlik toplama plakalarını bir gecede 25 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi öğleden sonra, larvaların çoğu yumurtadan çıkmış olacak.

Tahlilin tek bir çalışması için, deneysel grup başına en az beş tahlil plakası hazırlayın. Isıtarak 700 mililitre deiyonize suya 16 gram sinek agar ekleyin. % 95 etanolde 17,5 mililitre Nipagen hazırlayın. Agar çözeltisini neredeyse tamamen çözünene kadar ısıtın. Sonra agar çözeltisine Nipagen çözeltisi ekleyin ve agar tamamen çözünene kadar ısıtın. Agar çözeltisini kısaca soğutun, ardından 15 mililitrelik agar çözeltisi ile 10 santimetre plaka yükleyin. Agar jelleri bir kez, tabaklara kapaklar koyun ve birkaç saat veya gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın.

Kürlenmiş agar dokunmaya sıkı olmalı ve parçalar kesildiğinde ufalanmaya direnmelidir. Agar iyileştikten sonra, her plakadaki agar jelinde merkezi bir delik açmak için 1,5 santimetrelik bir mantar borer kullanın.

Larvaları test plakasına aktarmak için basit bir alet yapın. Bir eğriyi plastik bir mikrospatulanın ucuna bükün ve larvalara yapışkan hale getirmek için ucu maya ezmesine batırın. Şimdi ilk instar larvaları tek tek alın ve gıda höyüğüne yakın agar plakasına yerleştirin. Her deney grubu için, her biri 10 larvalı en az beş tabak hazırlayın.

Test kopyaları arasında tekrarlanabilirliği sağlamak için, her test plakasına sadece 10 larva yerleştirilmesi kritik öneme sahiptir. Mikrospatula ucuna sahip bir larvayı her teslim ettirdiğinizde bir ve sadece bir larva transferinin olduğunu belirlemek için test plakasını dikkatlice kontrol etmeyi unutmayın.

Plaka yüklendikten sonra etiketle, örtün, sonra oda sıcaklığında kapak tarafı yukarı olacak şekilde karanlığa yerleştirin. Tüm larvalar ölene veya yavrulanana kadar her tabağı günlük olarak inceleyin. İşte tahlillerin ikinci gününden sekizinci gününe kadar vahşi tip suşu için plaka örnekleri. İkinci gün larvalar yiyeceğe gömülür ve tünel oluşmaz. Tünelleme üçüncü günde başlar ve larvalar tünellerinde dolaşmayı ve yavrulamayı durdurduğu için beş ila sekiz gün arasında maksimuma ulaşır.

Bükülmüş bir alay iğnesi ile pupayı dikkatlice bir üzüm tabağına aktarın ve istenirse, kaç pupa atlı olduğunu sayın. Pupa oluşumunu not alın ve pupaları anormallikler açısından değerlendirin.