Chorion وفيتيلين إزالة الغشاء الميكانيكية: طريقة لإعداد الخلايا ال Oocytes Drosophila للمراقبة المباشرة

Overview

يصف هذا الفيديو طريقة لإزالة أغشية الكوريون والفيتيلين ميكانيكيا من البويضات الدروسولية الناضجة الثابتة سابقا. يظهر البروتوكول المميز عرضا مفصلا للإجراء الذي ينتج عنه بويضات متوافقة مع المقايسات الفلورية في الموقع للتهجين.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من بيركنز وبيكل، وذلك باستخدام الفلورسينس في التهجين في الموقع (FISH) لرصد حالة تماسك الذراع في بروميتافاس وميتافاس الأول Drosophila Oocytes، J. Vis. Exp. (2017).

1. إزالة Chorions والأغشية Vitelline

ملاحظة: انظر الشكل 1 للاطلاع على الأدوات اللازمة.

1. فصل البويضات في مرحلة متأخرة
   1. إضافة 1 مل PBSBTx إلى طبق تشريح الضحلة. استخدم P200 مع طرف مغلف ب BSA لنقل المبيضين الثابتين (ب ~ 150 ميكرولتر) إلى الطبق الضحل. المبيضين ماصة صعودا وهبوطا مع طرف ماصة المغلفة BSA لطرد البويضات ناضجة من البويضات أقل نضجا.
   2. عندما يتم فصل البويضات في مرحلة متأخرة بما فيه الكفاية، نقل جميع الأنسجة إلى أنبوب ميكروفوج 500 ميكرولتر. إزالة السائل الزائد مع ماصة باستور سحبت، وترك حوالي 150-200 ميكرولتر في الأنبوب. كرر القسم 1.1 للأنماط الجينية المتبقية.
2. الاستعداد للدرفلة
   1. قبل الرطب طبق بئر عميق مع 200 ميكروغرام من PBSBTx. تغطية وتنحى جانبا. الحصول على 3 شرائح زجاجية متجمدة ووضع الشريحة #3 جانبا. فرك بلطف المناطق الزجاجية المتجمدة من الشرائح #1 #2 معا. شطف لهم في الماء deionized لإزالة أي شظايا الزجاج والجافة مع مسح المتاح.
   2. معطف المناطق المتجمدة من الشرائح #1 #2 مع PBSBTx بإضافة 50 ميكرولتر من PBSBTx إلى شريحة واحدة وفرك هذه المنطقة مع الشريحة الأخرى. إزالة السائل مع مسح المتاح.
   3. ضع الشرائح تحت مجهر تشريح في التكوين الموضح في الشكل 2A. حافظ على المناطق المتجمدة من الشرائح #1 #2 على اتصال، مع #2 الشرائح الداعمة #3 الشرائح.
3. لفة البويضات; التأكد من أن اتجاه المتداول هو دائما في خط مستقيم وأبدا حركة دائرية.
   1. Prewet تلميح ماصة P200 في PBSBTx وتفريق البويضات في أنبوب microfuge عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. نقل 50 ميكرولتر من السائل الذي يحتوي على البويضات إلى مركز الجزء الزجاجي المتجمد من الشريحة #1. رفع الشريحة #2 للقيام بذلك.
   2. انخفاض ببطء الشريحة #2 حتى التوتر السطحي للسائل يخلق ختم بين المنطقتين الزجاج متجمد. يجب أن يكون هناك ما يكفي من السائل لتغطية منطقة متجمد ولكن لا ينبغي أن يتسرب أي منها. إذا كان السائل يفيض، استخدم ماصة باستور سحبت لإزالة السائل الزائد.
   3. امسك الشريحة السفلية (#1) في مكانها بيد واحدة واستخدم اليد الأخرى لتحريك الشريحة العلوية (#2) ذهابا وإيابا في اتجاه أفقي، مع الحفاظ على مستوى الشريحة #2 ومدعمة على #3 الشرائح. أداء تحت المجهر لسهولة التصور من حركات البويضات والتقدم.
      ملاحظة: هذه الحركة سوف تولد الاحتكاك وتسبب البويضات إلى "لفة" وتفقد المشيمات الخاصة بهم. وينبغي استخدام الحد الأدنى من الضغط وينبغي أن تكون الحركات قصيرة وسريعة.
   4. بعد بضع حركات في الاتجاه الأفقي، تغيير طفيف في زاوية الحركة (الشكل 2B). بزيادات متعددة، قم بزيادة هذه الزاوية تدريجيا إلى 90 درجة حتى تصبح حركة الشريحة العلوية (#2) عمودية على اتجاهالبداية (الشكل 2B). لاحظ أن الكورونات الفارغة ستكون مرئية في السائل وستظهر البويضات التي تفتقر إلى الكورونات لفترة أطول وأرق.
   5. كرر الخطوات 1.3.3 - 1.3.4 حوالي 7 - 10 مرات حتى يصبح الحل غائما قليلا. توقف عن الدوران عندما تكون غالبية البويضات (75 - 85٪) يبدو أنها فقدت أغشيتها الواهية.
      ملاحظة: غالبا ما تكون النهاية المميزة مدببة مرئية على البويضات التي تفتقر إلى الأغشية الهوتيلية. الأغشية الستيلينية هي أكثر صعوبة لإزالة من الكورونات. يمكن تطبيق ضغط الضوء على الشريحة العلوية (الشريحة #2) أثناء الدوران لتحقيق إزالة الأغشية الواهية. في محاولة لإزالة الأغشية vitelline من جميع البويضات غالبا ما يؤدي إلى تدمير البويضات الأخرى.
   6. ارفع الشريحة العلوية برفق (#2) ، وسحب إحدى زواياها إلى وسط المنطقة المتجمدة من الشريحة السفلية (#1) بحيث تتراكم البويضات المدلفنة في وسط المنطقة المتجمدة. شطف البويضات من كل الشرائح مع PBSBTx في طبق بئر عميق يحتوي على PBSBTx.
   7. الشرائح النظيفة #1 #2 مع المياه فائقة الشراء، الجافة مع مسح المتاح، وإعادة تعيين. كرر الخطوات 1.3.1 - 1.3.6 حتى يتم تدحرج جميع البويضات من نفس النمط الجيني. وهذا يتطلب عادة 3-4 جولات من المتداول في النمط الجيني.
4. إزالة الحطام بعد التدحرج
   1. إضافة 1 مل PBSBTx إلى أنبوب مخروطي 15 مل. دوامة السائل لمعطف الجانبين من الأنبوب.
   2. باستخدام تلميح P1000 ماصة مغلفة PBSBTx، نقل البويضات المدرفلة من طبق البئر العميق إلى أنبوب مخروطي يحتوي على 1 مل من PBSBTx. إضافة 2 مل إضافية من PBSBTx إلى أنبوب مخروطي يحتوي على البويضات.
   3. دع البويضات تبدأ في الاستقرار إلى القاع ، ثم قم بإزالة أعلى 2 مل من المحلول الذي يحتوي على الحطام (chorions ، vitellines ، وما إلى ذلك)مع P1000 والتخلص منها. إذا لزم الأمر، عقد أنبوب مخروطي على خلفية مظلمة لرؤية البويضات مبهمة لأنها تغرق.
   4. إضافة إضافية 2 مل من PBSBTx إلى البويضات، وكرر الخطوة 1.4.3. كرر 1.4.3. لما مجموعه 3 جولات من إزالة الحطام.
   5. باستخدام تلميح P1000 ماصة المغلفة PBSBTx، نقل البويضات مرة أخرى إلى أنبوب الميكروفون الأصلي 500 ميكرولتر. 20 - 25 يجب أن تنتج الإناث ما يقرب من 50 ميكرولتر من البويضات الناضجة المدلفنة.
5. كرر القسم 4 للأنماط الجينية المتبقية باستخدام الشرائح المتجمدة الطازجة ، وطبق بئر عميق نظيف ، وأنبوب مخروطي جديد لكل نمط جيني.
6. إذا كان التخزين ضروريا، قم بنقل البويضات إلى برنامج تلفزيوني 1x مع 0.1٪ TritionX-100 وتخزينها بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. لا ينصح بالتخزين طويل الأجل لأن الفورمالديهايد يمكن عكسه بواسطة المنظفات غير الأيونية.

Representative Results

الشكل 1: أدوات علم الخلايا. الأدوات المستخدمة في البروتوكول: (1) زوج من ملقط (#5 دومون); (2) إبرة التنغستن؛ (3) طبق بئر عميق مع غطاء؛ (4) طبق تشريح الزجاج الضحلة؛ (5) سحبت باستور ماصة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: ترتيب وحركة الشرائح للبويضات المتداول. (أ) رسم تخطيطي للشريحة التي تم إعدادها لتدحرج البويضات كما هو موضح في البروتوكول. تشير المنطقة الداكنة إلى الجزء الزجاجي المتجمد من الشريحة. (ب) اتجاه ناقلات الحركة للشريحة #2 أثناء المتداول البويضات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100	Prepare 10% stock Freeze aliquots
10% Triton X-100	Thermo Scientific	28314	Surfact-Amps
PBSBTx			1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
Forceps	Dumont		#5 INOX, Biologie
9" Disposable glass Pasteur pipettes	Fisher	13-678-20C	Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish			Custom made
Deep well dish (3 wells)	Pyrex	7223-34
Tungsten needle			homemade
Frosted glass slides, 25 x 75 mm	VWR Scientific	48312-002
15 mL conical tubes	Various
500 µl microfuge tubes	Various
Kimwipes	Various		disposable wipes