Overview
Cette vidéo décrit une méthode pour enlever mécaniquement les membranes chorion et vitelline des ovocytes Drosophila matures précédemment fixés. Le protocole en vedette montre une démonstration détaillée de la procédure de rendement des ovocytes compatibles avec les analyses d’hybridation in situ fluorescente.
Protocol
Ce protocole est un extrait de Perkins et Bickel, Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2017).
1. Enlèvement des membranes Chorions et Vitelline
REMARQUE: Voir la figure 1 pour les outils nécessaires.
- Ovocytes séparés à un stade avancé
- Ajouter 1 mL PBSBTx à un plat de dissecting peu profond. Utilisez un P200 avec une pointe enduite BSA pour transférer les ovaires fixes (en ~150 μL) dans le plat peu profond. Ovaires pipette de haut en bas avec la pointe de pipette enduite BSA pour déloger les ovocytes matures des ovocytes moins matures.
- Lorsque les ovocytes à un stade avancé sont suffisamment séparés, transférez tout le tissu dans un tube de microfuge de 500 μL. Retirer l’excès de liquide avec une pipette Pasteur tirée, en laissant environ 150 à 200 μL dans le tube. Répétez la section 1.1 pour les génotypes restants.
- Préparez-vous à rouler
- Pré-mouiller un plat de puits profond avec 200 μL de PBSBTx. Couvrir et réserver. Obtenez 3 glissières en verre givré et mettez la #3 côté. Frottez doucement les régions de verre givré des #1 et #2 ensemble. Rincez-les à l’eau déionisée pour enlever les éclats de verre et séchez-les à l’aide d’un lingette jetable.
- Enduire les régions givrées de diapositives #1 et #2 de PBSBTx en ajoutant 50 μL de PBSBTx à une diapositive et en frottant cette région avec l’autre diapositive. Retirer le liquide avec un lingette jetable.
- Placez les diapositives sous un microscope disséquant dans la configuration indiquée à la figure 2A. Gardez les régions givrées de diapositives #1 et #2 en contact, avec des diapositives #3 des #2.
- Rouler les ovocytes; s’assurer que la direction du roulement est toujours en ligne droite et jamais en mouvement circulaire.
- Préjugez une pointe de pipette P200 dans PBSBTx et dispersez les ovocytes dans le tube de microfuge en descendant de haut en bas. Transférer 50 μL de liquide contenant des ovocytes au centre de la partie en verre givré de la #1. Soulevez la #2 pour ce faire.
- Baissez lentement la #2 jusqu’à ce que la tension de surface du liquide crée un joint entre les deux régions de verre givré. Il devrait y avoir suffisamment de liquide pour couvrir la zone givré, mais aucun ne devrait s’infiltrer. Si le liquide déborde, utilisez une pipette Pasteur tirée pour éliminer l’excès de liquide.
- Maintenez la glissière inférieure (#1) en place d’une main et utilisez l’autre main pour déplacer la glissière supérieure (#2) dans une direction horizontale, en gardant le niveau de #2 de diapositives et en soutien sur les #3 de diapositives. Effectuer au microscope pour une visualisation facile des mouvements et des progrès des ovocytes.
REMARQUE: Ce mouvement générera une friction et fera « rouler » les ovocytes et perdra leurs chorions. Une pression minimale doit être utilisée et les mouvements doivent être courts et rapides. - Après quelques mouvements dans la direction horizontale, modifiez légèrement l’angle de mouvement(figure 2B). Par incréments multiples, augmenter graduellement cet angle à 90° jusqu’à ce que le mouvement de la diapositive supérieure (#2) soit perpendiculaire à la direction de départ (figure 2B). Notez que les chorions vides seront visibles dans le liquide et les ovocytes dépourvus de chorions apparaîtront plus longs et plus minces.
- Répétez les étapes 1.3.3 - 1.3.4 environ 7 - 10 fois jusqu’à ce que la solution devienne légèrement nuageuse. Arrêter de rouler lorsque la majorité des ovocytes (75 - 85%) semblent avoir perdu leurs membranes vitelline.
REMARQUE: Une extrémité pointue distinctive est souvent visible sur les ovocytes dépourvus de membranes vitelline. Les membranes vitelline sont plus difficiles à enlever que les chorions. La pression lumineuse peut être appliquée sur la glissière supérieure (#2) tout en roulant pour obtenir l’enlèvement des membranes vitelline. Essayer d’enlever les membranes vitelline de tous les ovocytes entraîne souvent la destruction d’autres ovocytes. - Soulevez doucement la glissière supérieure (#2), en faisant glisser l’un de ses coins vers le centre de la région givré de la glissière inférieure (#1) de sorte que les ovocytes roulés s’accumulent au centre de la région givré. Rincer les ovocytes des deux toboggans avec du PBSBTx dans le plat de puits profond contenant du PBSBTx.
- Nettoyez les glissières #1 et #2 l’eau ultrapure, séchez-les avec un lingette jetable et réinitialisez-les. Répétez les étapes 1.3.1 - 1.3.6 jusqu’à ce que tous les ovocytes du même génotype aient été roulés. Cela nécessite généralement de 3 à 4 tours de roulement par génotype.
- Enlever les débris après le roulis
- Ajouter 1 mL PBSBTx à un tube conique de 15 mL. Faites tourbillonner le liquide pour enrober les côtés du tube.
- À l’aide d’une pointe de pipette PBSBTx enduite P1000, transférer les ovocytes roulés du plat du puits profond au tube conique contenant 1 mL de PBSBTx. Ajouter 2 mL supplémentaires de PBSBTx au tube conique contenant les ovocytes.
- Laissez les ovocytes commencer à se déposer vers le bas, puis retirez les 2 mL de solution supérieure contenant des débris (chorions, vitellines, etc.)avec un P1000 et jetez. Si nécessaire, maintenez le tube conique sur un fond sombre pour voir les ovocytes opaques pendant qu’ils coulent.
- Ajouter 2 mL supplémentaires de PBSBTx aux ovocytes et répéter l’étape 1.4.3. Répétez 1.4.3. pour un total de 3 tours d’enlèvement des débris.
- À l’aide d’une pointe de pipette PBSBTx enduite P1000, transférez les ovocytes vers le tube de microfuge original de 500 μL. 20 à 25 femelles devraient produire environ 50 μL d’ovocytes matures roulés.
- Répétez la section 4 pour les génotypes restants à l’aide de toboggans frais givrés, d’un plat propre et profond et d’un nouveau tube conique pour chaque génotype.
- Si le stockage est nécessaire, transférer les ovocytes à 1x PBS avec 0,1% TritionX-100 et stocker toute la nuit à 4 °C. Le stockage à long terme n’est pas recommandé parce que le croisement de formaldéhyde peut être inversé par des détergents non ioniques.
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Representative Results
Figure 1 : Outils de cytologie. Outils utilisés dans le protocole : (1) paire de forceps (#5 Dumont); (2) aiguille de tungstène; (3) bien profond plat avec couvercle; (4) plat de dissecting en verre peu profond ; (5) tiré pipette Pasteur. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Arrangement et mouvement des toboggans pour les ovocytes roulants. (A) Diagramme de la diapositive mise en place pour le roulement des ovocytes tel que décrit dans le protocole. La zone plus foncée désigne la partie en verre givré de la glissière. (B) Direction des vecteurs de mouvement pour les glissements #2 pendant le roulement des ovocytes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | Prepare 10% stock Freeze aliquots |
| 10% Triton X-100 | Thermo Scientific | 28314 | Surfact-Amps |
| PBSBTx | 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100 | ||
| Forceps | Dumont | #5 INOX, Biologie | |
| 9" Disposable glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | Autoclave to sterilize |
| Shallow glass dissecting dish | Custom made | ||
| Deep well dish (3 wells) | Pyrex | 7223-34 | |
| Tungsten needle | homemade | ||
| Frosted glass slides, 25 x 75 mm | VWR Scientific | 48312-002 | |
| 15 mL conical tubes | Various | ||
| 500 µl microfuge tubes | Various | ||
| Kimwipes | Various | disposable wipes |
