乔里翁和维泰琳膜机械去除：一种为直接观察准备 果蝇 卵母细胞的方法

Overview

此视频描述了一种从先前固定的成熟 磷 母细胞中机械地去除胆汁和维特尔线膜的方法。特色协议详细演示了产生与荧光相容 的原位 杂交测定程序。

Protocol

此协议是珀金斯和比克尔的摘录，使用荧光原位杂交 （FISH） 来监测蛋白相和元相 I德罗索菲拉卵母细胞中的手臂凝聚状态，J. Vis. Exp .(2017).

1. 去除乔里翁和维泰琳膜

注：有关所需的工具，请参阅图 1。

1. 单独的晚期卵母细胞
   1. 将 1 mL PBSBTx 添加到浅解剖盘中。使用带有 BSA 涂层尖端的 P200 将固定卵巢（在 +150 μL 中）转移到浅盘中。派佩特卵巢上下与BSA涂层移液器尖端，以驱逐成熟的卵母细胞从不太成熟的卵母细胞。
   2. 当晚期卵母细胞充分分离时，将所有组织转移到 500 μL 微富格管中。用拉式巴斯德移液器去除多余的液体，将大约 150 - 200 μL 留在管中。对于剩余的基因型重复第 1.1 节。
2. 准备滚动
   1. 用 200μl 的 Pbsbtx 预湿深井盘， 盖上盖子， 放在一边。获取 3 个磨砂玻璃滑梯，并将滑梯放在一边#3。轻轻地将滑梯的磨砂玻璃区域#1，并将#2揉在一起。在除离子水中冲洗，去除任何玻璃碎片，用一次性擦拭擦干。
   2. 将 50 μL 的 PBSBTx 添加到一张幻灯片中，并将此区域与另一张幻灯片摩擦，从而将滑梯的磨砂区域涂上#1，并与 PBSBTx #2。用一次性擦拭去除液体。
   3. 将幻灯片放在解剖显微镜下，以 图 2A显示的配置。保持滑梯的磨砂区域#1和#2接触，滑动#3支持幻灯片#2。
3. 滚动卵母细胞;确保滚动的方向始终处于直线，并且永远不会呈圆形运动。
   1. 在 PBSBTx 中预制 P200 移液器尖端，并通过上下管道分散微管中的卵母细胞。将含有卵母细胞的 50μL 液体转移到滑动#1的磨砂玻璃部分的中心。抬起滑梯#2做到这一点。
   2. 缓慢降低滑动#2，直到液体表面张力在两个磨砂玻璃区域之间形成密封。应该有足够的液体覆盖磨砂区域，但任何液体都不应渗出。如果液体溢出，使用拉巴斯德移液器去除多余的液体。
   3. 用一只手将底部幻灯片（#1）放在原位，用另一只手向水平方向来回移动顶部幻灯片（#2），将幻灯片保持在#2水平，并在幻灯片#3上支撑。在显微镜下执行，便于可视化卵母细胞运动和进度。
      注： 这种运动会产生摩擦，导致卵母细胞"滚动"并失去它们的胆汁。应使用最小的压力，运动应短而快。
   4. 在水平方向进行几个动作后，稍微改变运动角度（图2B）。在多个增量中，逐渐将此角度增加到 90°，直到顶部滑梯（#2）的移动垂直于起始方向（图 2B）。请注意，在液体中可以看到空的胆汁，没有胆汁的卵母细胞会显得更长更薄。
   5. 重复步骤 1.3.3 - 1.3.4 约 7 - 10 次，直到解决方案变得略为多云。当大多数卵母细胞 （75 - 85%） 时停止滚动似乎已经失去了他们的维特尔线膜。
      注： 在缺乏葡萄胶膜的卵母细胞上，通常可以看到一个独特的尖端。维泰琳膜比胆汁更难去除。轻压可应用于顶部滑梯（滑动#2），同时滚动以实现葡萄胶膜的去除。试图从所有的卵母细胞中去除维他林膜通常会导致其他卵母细胞的破坏。
   6. 轻轻地抬起顶部滑梯（#2），将其中一个角拖至底部滑梯（#1）的磨砂区域中心，使滚卵母细胞积聚在磨砂区域的中心。用PBSBTx将两个滑梯中的卵母细胞冲洗到含有PBSBTx的深井盘中。
   7. 用超纯水清洁滑梯#1和#2，用一次性擦拭干燥，并重置。重复步骤 1.3.1 - 1.3.6，直到同一基因型的所有卵母细胞都已滚动。这通常需要 3 - 4 轮滚动每个基因型。
4. 滚动后清除碎屑
   1. 将 1 mL PBSBTx 添加到 15 mL 圆锥管中。旋转液体以涂覆管子的两侧。
   2. 使用 PBSBTx 涂层 P1000 移液器尖端，将卷起的卵母细胞从深井盘转移到含有 1 mL PBSBTx 的圆锥管中。在含有卵母细胞的圆锥管中再添加 2 mL PBSBTx。
   3. 让卵母细胞开始沉降到底部，然后用P1000去除含有碎屑（胆汁、颤音 等）的2mL溶液的顶部，然后丢弃。如果需要，将圆锥管保持在黑暗的背景上，在它们下沉时看到不透明的卵母细胞。
   4. 向卵母细胞添加额外的 2 mL PBSBTx，然后重复步骤 1.4.3。重复 1.4.3。共清除3轮碎片。
   5. 使用 PBSBTx 涂层 P1000 移液器尖端，将卵母细胞转移回原来的 500 μL 微胶管。20 - 25 雌性应产生大约 50μL 的滚动成熟卵母细胞。
5. 使用新鲜磨砂滑梯、干净的深井盘和每个基因型的新圆锥形管重复第 4 节。
6. 如果存储是必要的，将卵母细胞转移到1x PBS与0.1%TritionX-100和存储过夜在4°C。 不建议长期储存，因为甲醛交叉链接可以通过非离子洗涤剂逆转。

Representative Results

图1：细胞学工具。 协议中使用的工具：（1） 一对钳子（杜蒙#5）：（二）钨针：（3）深井盘盖：（四）浅玻璃解剖盘：（5） 拉巴斯德移液器。 请单击此处查看此图的更大版本。

图2：滚动卵母细胞幻灯片的排列和运动。（A）协议中描述的用于滚动卵母细胞的幻灯片图。较暗的区域表示幻灯片的磨砂玻璃部分。（B）卵母细胞滚动过程中滑动#2运动向量的方向。请单击此处查看此图的更大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100	Prepare 10% stock Freeze aliquots
10% Triton X-100	Thermo Scientific	28314	Surfact-Amps
PBSBTx			1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
Forceps	Dumont		#5 INOX, Biologie
9" Disposable glass Pasteur pipettes	Fisher	13-678-20C	Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish			Custom made
Deep well dish (3 wells)	Pyrex	7223-34
Tungsten needle			homemade
Frosted glass slides, 25 x 75 mm	VWR Scientific	48312-002
15 mL conical tubes	Various
500 µl microfuge tubes	Various
Kimwipes	Various		disposable wipes