초리온 및 비텔린 멤브레인 기계적 제거: 직접 관찰을 위해 드로소필라 오퀴트를 준비하는 방법

Overview

이 비디오는 이전에 고정된 성숙한 Drosophila oocytes에서 초리온 및 비텔린 멤브레인을 기계적으로 제거하는 방법을 설명합니다. 특징프로토콜은 시투 혼성화 분석서에서 형광과 호환되는 난모세포를 산출하는 절차의 상세한 데모를 보여줍니다.

Protocol

이 프로토콜은 퍼킨스와 빅켈에서 발췌, 시투 혼성화에서 형광을 사용하여 (FISH) 프로 메타 단계와 메타 위상 I Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp에서팔 응집력의 상태를 모니터링. (2017).

1. 치리온 및 비텔린 멤브레인 제거

참고: 필요한 도구의 경우 그림 1을 참조하십시오.

1. 별도의 후기 단계 난모세포
   1. 얕은 해부 접시에 1mL PBSBTx를 추가합니다. BSA 코팅 팁이 있는 P200을 사용하여 고정 난소(~150 μL)를 얕은 접시에 옮길 수 있습니다. 파이펫 난소는 BSA 코팅 파이펫 팁으로 위아래로 변해 성숙한 난모세포에서 성숙한 난모세포를 빼낼 수 있습니다.
   2. 후기 단계 난모세포가 충분히 분리되면 모든 조직을 500 μL 마이크로퍼지 튜브로 옮깁니다. 당겨진 파스퇴르 파이펫으로 여분의 액체를 제거하고 튜브에 약 150 - 200 μL을 남깁니다. 남은 유전자형에 대해 1.1을 반복합니다.
2. 롤링 준비
   1. PBSBTx. 커버의 200 μL와 깊은 우물 요리를 미리 적시고 따로 둡니다. 서리가 내린 유리 슬라이드 3장을 가져와 슬라이드#3 옆으로 설정합니다. #1 슬라이드의 서리가 내린 유리 영역을 부드럽게 문지르고 함께 #2. 탈이온화된 물에 헹구어 유리 파편을 제거하고 일회용 물티슈로 건조시다.
   2. 한 슬라이드에 PBSBTx의 50 μL을 추가하고 다른 슬라이드로이 영역을 문질러 PBSBTx와 #1 #2 슬라이드의 서리가 내린 영역을 코팅합니다. 일회용 닦아액체를 제거합니다.
   3. 도 2A에도시된 구성에 해부 현미경 아래에 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드 #3 지원 슬라이드 #2 #1 #2 서리가 내린 영역을 유지합니다.
3. 난모세포 롤; 롤링방향이 항상 직선으로 되어 있고 원형 동작이 없도록 합니다.
   1. PBSBTx에 P200 파이펫 팁을 미리 넣고 마이크로퍼지 튜브의 난미를 위아래로 피펫하여 분산시합니다. 미끄럼틀의 서리가 내린 유리 부분의 중심으로 난모세포가 함유된 액체 50 μL을 #1. 이 작업을 수행 하려면 #2 리프트 슬라이드.
   2. 액체의 표면 장력이 두 서리가 내린 유리 영역 사이에 씰을 생성 할 때까지 천천히 낮은 슬라이드 #2. 서리가 내린 지역을 덮을 충분한 액체가 있어야하지만 아무도 꺼져서는 안됩니다. 액체가 넘쳐나는 경우 당겨진 파스퇴르 파이펫을 사용하여 과도한 액체를 제거하십시오.
   3. 하단 슬라이드(#1)를 한 손으로 제자리에 고정하고 다른 손으로 상단 슬라이드(#2)를 수평 방향으로 앞뒤로 이동하여 슬라이드 #2 레벨을 유지하고 슬라이드 #3 지지합니다. 난소 운동과 진행의 쉬운 시각화를 위해 현미경으로 수행.
      참고: 이 움직임은 마찰을 생성하고 난모세포가 "롤"하고 그들의 chorions를 잃게합니다. 최소한의 압력을 사용해야 하며 움직임은 짧고 빠를 수 있습니다.
   4. 수평 방향으로 몇 번의 움직임 후, 약간 움직임의 각도를 변경(도 2B). 여러 증분에서, 상단 슬라이드(#2)의 움직임이 시작방향(도2B)에수직이 될 때까지 이 각도를 90°로 점진적으로 증가시다. 빈 축고는 액체에서 볼 수 있으며, 축색이 없는 난모세포는 더 길고 얇아 보입니다.
   5. 용액이 약간 흐리게 될 때까지 1.3.3 - 1.3.4 약 7 - 10 번 반복하십시오. 난모세포의 대다수 (75 - 85%)가 롤링 중지 비텔린 멤브레인을 잃은 것으로 보입니다.
      참고: 독특한 뾰족한 끝은 종종 바이텔린 멤브레인이 부족한 난모세포에서 볼 수 있습니다. 비텔린 멤브레인은 chorions보다 제거하기가 더 어렵습니다. 진동막 제거를 위해 압연하는 동안 상단 슬라이드(슬라이드 #2)에 광압이 가해질 수 있다. 모든 난모세포에서 바이텔린 멤브레인을 제거하려고 하면 종종 다른 난모세포가 파괴됩니다.
   6. 상단 슬라이드(#2)를 부드럽게 들어 올리고 모서리 중 하나를 아래쪽 슬라이드(#1)의 서리가 내린 영역의 중심으로 드래그하여 압연 난동체가 서리가 내린 영역의 중앙에 축적되도록 합니다. PBSBTx와 함께 두 슬라이드에서 OOCYTES를 PBSBTx가 함유된 깊은 웰 디쉬로 헹구십시오.
   7. 깨끗한 슬라이드#1 초순수물로 #2, 일회용 물티슈로 건조하고 재설정합니다. 동일한 유전자형의 모든 난피세포가 압연될 때까지 1.3.1 - 1.3.6 단계를 반복합니다. 이것은 일반적으로 유전자형 당 3 - 4 회 압연의 라운드를 필요로한다.
4. 압연 후 이물질을 제거
   1. 15mL 원문 튜브에 1mL PBSBTx를 추가합니다. 액체를 소용돌이쳐 튜브의 측면을 코팅합니다.
   2. PBSBTx 코팅 P1000 파이펫 팁을 사용하여, PBSBTx의 1mL을 포함하는 원피스 튜브에 깊은 우물 접시에서 압연 난모구를 전송.
   3. 난모세포가 바닥에 정착하기 시작한 다음 P1000으로 이물질(chorions, vitellines 등)을포함하는 용액의 상위 2mL을 제거하고 폐기하십시오. 필요한 경우 원물 튜브를 어두운 배경에 대고 가라앉을 때 불투명한 난모를 볼 수 있습니다.
   4. 난모세포에 PBSBTx2mL을 추가하고 1.4.3단계를 반복합니다. 1.4.3을 반복합니다. 총 3발의 잔해 제거.
   5. PBSBTx 코팅 P1000 파이펫 팁을 사용하여, 원래 500 μL 마이크로퍼지 튜브로 다시 난모세포를 전송합니다. 20 - 25 여성은 압연 성숙한 난모세포의 약 50 μL을 산출한다.
5. 신선한 서리가 내린 슬라이드, 깨끗한 깊은 우물 접시 및 각 유전자형에 대한 새로운 원식 튜브를 사용하여 나머지 유전자형에 대한 섹션 4를 반복합니다.
6. 보관이 필요한 경우 0.1% TritionX-100으로 1배 PBS로 난토를 옮기고 4°C에서 하룻밤을 보관하십시오. 포름알데히드 크로스링크는 비이온 세제에 의해 되돌릴 수 있기 때문에 장기 보관은 권장되지 않습니다.

Representative Results

그림 1: 세포학 도구. 프로토콜에 사용되는 도구: (1) 집게(#5 듀몬트); (2) 텅스텐 바늘; (3) 커버와 깊은 우물 요리; (4) 얕은 유리 해부 접시; (5) 파스퇴르 파이펫을 당겼다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 압연 난모세포에 대한 슬라이드의 배열 및 이동. (A) 프로토콜에 설명된 대로 난모세포의 롤링을 위해 설정된 슬라이드의 다이어그램입니다. 어두운 영역은 슬라이드의 서리가 내린 유리 부분을 나타냅니다. (B) 난마세포 압연 중 슬라이드 #2 대한 이동 벡터의 방향. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100	Prepare 10% stock Freeze aliquots
10% Triton X-100	Thermo Scientific	28314	Surfact-Amps
PBSBTx			1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
Forceps	Dumont		#5 INOX, Biologie
9" Disposable glass Pasteur pipettes	Fisher	13-678-20C	Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish			Custom made
Deep well dish (3 wells)	Pyrex	7223-34
Tungsten needle			homemade
Frosted glass slides, 25 x 75 mm	VWR Scientific	48312-002
15 mL conical tubes	Various
500 µl microfuge tubes	Various
Kimwipes	Various		disposable wipes