Хорион и Vitelline Membrane Механическое удаление: Метод подготовки drosophila Oocytes для прямого наблюдения

Overview

Это видео описывает метод механического удаления хорионные и вителлиновые мембраны из ранее зафиксированных зрелых ооцитов дрозофилы. Рекомендуемый протокол показывает подробную демонстрацию процедуры, вызвечивающих яйцеклетки, совместимые с флуоресцентными анализами гибридизации на месте.

Protocol

Этот протокол является выдержка из Перкинс и Bickel, используя флуоресценции на месте гибридизации (FISH) для мониторинга состояния сплочения рук в Прометафазе и метафазы я Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2017).

1. Удаление хорионов и вителлиновых мембран

ПРИМЕЧАНИЕ: См. рисунок 1 для необходимых инструментов.

1. Отдельные ооциты поздней стадии
   1. Добавьте 1 мл PBSBTx в мелкое рассечение. Используйте P200 с наконечником с покрытием BSA для переноса фиксированных яичников (в 150 йл) в мелкое блюдо. Pipette яичников вверх и вниз с BSA покрытием пипетки отзыв выбить зрелые яйцеклетки из менее зрелых яйцеклеток.
   2. При достаточном разделении яйцеклеток поздней стадии перенесите все ткани в микрофуговую трубку на 500 мкл. Удалите излишки жидкости с вытащил Пастер пипетки, оставив около 150 - 200 йл в трубке. Повторите раздел 1.1 для остальных генотипов.
2. Подготовка к прокатке
   1. Предварительно влажный глубокий хорошо блюдо с 200 йл PBSBTx. Обложка и отложите в сторону. Получить 3 матовыми стеклянными горками и установить слайд #3 сторону. Аккуратно протрите матовым стеклом области слайдов #1 и #2 вместе. Промыть их в дейонизированной воде, чтобы удалить любые осколки стекла и высушить одноразовой салфеткой.
   2. Пальто матовой области слайдов #1 и #2 с PBSBTx, добавив 50 йл PBSBTx на один слайд и трения этой области с другой слайд. Удалите жидкость с одноразовой салфеткой.
   3. Поместите слайды под рассечение микроскопа в конфигурации, показанной на рисунке 2A. Держите матовые области слайдов #1 и #2 контакте, с слайд-#3 поддерживающей слайд-#2.
3. Ролл-ооциты; убедитесь, что направление прокатки всегда находится в прямой линии и никогда не круговое движение.
   1. Prewet P200 пипетки отзыв в PBSBTx и разогнать яйцеклетки в микрофуге трубки трубопроводов вверх и вниз. Передача 50 МКЛ жидкости, содержащей яйцеклетки, в центр матовой стеклянной части слайд-#1. Поднимите слайд #2 сделать это.
   2. Медленно опустите #2 до тех пор, пока поверхностное натяжение жидкости не создаст уплотнение между двумя матовыми стеклянными областями. Там должно быть достаточно жидкости, чтобы покрыть матовой области, но никто не должен просачиваться. Если жидкость переполнена, используйте вытащил Пастер пипетки для удаления избыточной жидкости.
   3. Держите нижний слайд (#1) на месте с одной стороны и использовать другую руку, чтобы переместить верхний слайд (#2) вперед и назад в горизонтальном направлении, сохраняя уровень слайда #2 и поддерживается на слайд-#3. Выполните под микроскопом для легкой визуализации движений яйцеклеток и прогресса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это движение будет генерировать трение и привести к яйцеклетки "ролл" и теряют свои хорионы. Необходимо использовать минимальное давление, а движения должны быть короткими и быстрыми.
   4. После нескольких движений в горизонтальном направлении слегка измените угол движения(рисунок 2B). Несколькими шагами постепенно увеличиваем этот угол до 90 градусов, пока движение верхнего слайда (#2) не будет перпендикулярно исходному направлению(рисунок 2B). Обратите внимание, что пустые хорионы будут видны в жидкости и ооцитов не хватает chorions появится больше и тоньше.
   5. Повторите шаги 1.3.3 - 1.3.4 около 7 - 10 раз, пока раствор не станет слегка облачным. Остановить прокатки, когда большинство яйцеклеток (75 - 85%) как представляется, потеряли свои вителлин мембраны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отличительный остроконечный конец часто виден на ооцитах, не имеющих вителлиновых мембран. Вителлиновые мембраны труднее удалить, чем хорионы. Давление света может быть применено к верхней слайд (слайд #2) во время прокатки для достижения удаления вителлиновых мембран. Попытка удалить вителлин мембраны из всех яйцеклеток часто приводит к разрушению других яйцеклеток.
   6. Аккуратно поднимите верхнюю горку (#2), перетащив один из ее углов к центру матовой области нижней горки (#1), чтобы свернутые ооциты накапливались в центре матовой области. Промыть яйцеклетки из обоих слайдов с PBSBTx в глубокий хорошо блюдо, содержащее PBSBTx.
   7. Чистые горки #1 и #2 с ультрачистой водой, высушите одноразовой салфеткой и сбросите. Повторите шаги 1.3.1 - 1.3.6 до тех пор, пока не будут свернуты все ооциты одного и того же генотипа. Это обычно требует 3 - 4 раундов прокатки на генотип.
4. Удаление мусора после прокатки
   1. Добавьте 1 мл PBSBTx в коническую трубку 15 мл. Закружить жидкость, чтобы покрыть стороны трубки.
   2. Используя наконечник пипетки PBSBTx с покрытием P1000, перенесите свернутые яйцеклетки из глубокого хорошо блюда в коническую трубку, содержащую 1 мл PBSBTx. Добавьте дополнительные 2 мл PBSBTx в коническую трубку, содержащую ооциты.
   3. Пусть яйцеклетки начинают оседать на дно, а затем удалить верхние 2 мл раствора, содержащего мусор (хорионы, вители и т.д.)с P1000 и выбросить. При необходимости держите коническую трубку на темном фоне, чтобы увидеть непрозрачные яйцеклетки, как они тонут.
   4. Добавьте еще 2 мл PBSBTx в яйцеклетки и повторите шаг 1.4.3. Повторите 1.4.3. в общей сложности 3 раунда удаления мусора.
   5. Используя наконечник пипетки PBSBTx с покрытием P1000, перенесите ооциты обратно в оригинальную трубку микрофуг 500 йл. 20 - 25 самок должны дать около 50 мкл проката зрелых яйцеклеток.
5. Повторите раздел 4 для остальных генотипов с использованием свежих матовых слайдов, чистой глубокой посуды и новой конической трубки для каждого генотипа.
6. При необходимости хранения перенесите яйцеклетки в 1x PBS с 0,1% TritionX-100 и храните на ночь при 4 градусах Цельсия. Долгосрочное хранение не рекомендуется, потому что перекрестие формальдегида может быть обращено вспять неионическими моющими средствами.

Representative Results

Рисунок 1: Цитологические инструменты. Инструменты, используемые в протоколе: (1) пара force (#5 Дюмон); (2) вольфрамовая игла; (3) глубокое блюдо с крышкой; (4) мелкое стекло, рассекающая блюдо; (5) вытащил Пастер пипетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Расположение и движение слайдов для прокатки яйцеклеток. (A) Диаграмма слайда, настроенного для прокатки яйцеклеток, как описано в протоколе. Темная область обозначает матовую стеклянную часть слайда. (B) Направление векторов движения для слайд-#2 во время прокатки яйцеклеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100	Prepare 10% stock Freeze aliquots
10% Triton X-100	Thermo Scientific	28314	Surfact-Amps
PBSBTx			1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
Forceps	Dumont		#5 INOX, Biologie
9" Disposable glass Pasteur pipettes	Fisher	13-678-20C	Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish			Custom made
Deep well dish (3 wells)	Pyrex	7223-34
Tungsten needle			homemade
Frosted glass slides, 25 x 75 mm	VWR Scientific	48312-002
15 mL conical tubes	Various
500 µl microfuge tubes	Various
Kimwipes	Various		disposable wipes