Chemisch drogen: biologisch monsterpreparaat voor het scannen van elektronenmicroscopie (SEM)

Overview

Scanning elektronenmicroscopie (SEM) is een krachtig hulpmiddel om de oppervlaktekenmerken van een biologisch monster in beeld te brengen. Een goede monstervoorbereiding is echter van cruciaal belang voor het verkrijgen van kwaliteitsafbeeldingen. Deze video richt zich op de uitdrogings- en droogstappen van het voorbereiden van intacte volwassen Drosophila voor SEM.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit Koon et al., Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM), J. Vis. Exp. (2019).

1. Voorbereiding en fixatie

1. Bereid Drosophila melanogaster (fruitvlieg).
   1. Verdoof volwassen vliegen met 100% kooldioxide. Plaats verdoofde volwassenen (ongeveer 10 tot 30 vliegen) in een kleine plastic schroefdopflacon of 1,5 ml centrifugebuis.
   2. Dompel verdoofde vliegen onder in 1 ml fixatief (1,25% glutaraldehyde, 0,1 M fosfaatbuffer pH 7,2) gedurende 2 uur (of 's nachts) bij 4 °C. Als de vliegen naar het oppervlak van het fixatieve drijven, voeg dan een paar druppels van 2,5% polyethyleenglycol tert-octylfenylether toe om de oppervlaktespanning van het fixatieve te verzwakken, waardoor een totale onderdompeling van het weefsel mogelijk is. Verwijder het fixatief met behulp van een glazen pipet.

2. Wassen en uitdroging

1. Was en droog Drosophila melanogaster (fruitvlieg).
   1. Was het vaste monster driemaal met 1 ml 0,1 ml fosfaatbuffer pH 7,2 bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Verwijder elke wasbeurt met een glazen pipet en zorg ervoor dat u de vliegen niet verwijdert.
   2. Dehydrateer het monster met behulp van een gegradueerde ethanolreeks gedurende 10 minuten in een volume van 1 ml in een microfugebuis. De ethanolconcentraties zijn: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Verwijder de ethanol met een glazen pipet en zorg ervoor dat u de vliegen niet verwijdert.
   3. Bewaar het monster in de 1,5 ml microcentrifugebuis met net genoeg 100% ethanol om het monster te bedekken voordat u het droogt.

3. Drogen

1. Chemisch drogen met hexamethyldisilazane (HMDS).
   1. Vervang de 100% ethanoloplossing gedurende 20 minuten door een 1:2-oplossing van HMDS en 100% ethanol. Vervang de 1:2 oplossing door een 2:1 oplossing van HMDS en 100% ethanol gedurende 20 min. Vervang de 2:1 oplossing door 100% HMDS gedurende 20 min. Herhaal dit één keer.
      Opmerking: HMDS is ontvlambaar en een acuut toxine (huidroute). HMDS moet worden behandeld in een chemische zuurkast met behulp van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen, laboratoriumjas en oogbescherming.
   2. Breng het monster in HMDS, indien in een microcentrifugebuis van 1,5 ml, over in een wegwerpaluminiumweegschaal. Eenmaal in de aluminium weegschaal, vervang de 100% HMDS door net genoeg verse 100% HMDS om het monster te bedekken.
   3. Breng het monster over op een plastic of glazen niet-vacuümdesiccator met vers droogmiddel (5-6 cm diep) en plaats het in een chemische zuurkast. U kunt het monster ook direct in een chemische zuurkast plaatsen om te drogen met een los deksel, zoals een doos, om te voorkomen dat er vuil op het monster valt. Laat het monster 12 tot 24 uur drogen.

4. Montage

1. Mount Drosophila melanogaster (fruitvlieg).
   1. Label de onderkant van de aluminium montage stomp om aan te geven wat er bovenop wordt geplaatst.
      Plaats de gedroogde vliegen in de gewenste positie op een plak- of koolstoflijmlipje dat met een precisie-pincet aan de bovenkant van een stomp is bevestigd onder een ontleedmicroscoop.
   2. Breng zilvergeleidende lijm, d.w.z.zilververf, aan rond de buitenranden van de stubs. Verbind de zilververf met de vliegen met behulp van een tandenstoker om geleidbaarheid te garanderen. Laat de verf niet het gewenste beeldgebied raken.
   3. Plaats de stubs in een stomphouderdoos en plaats de open stomphouderdoos in een desiccator. Laat de zilververf minstens 3 uur of 's nachts drogen voor het beste resultaat.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/	The company doesn't appear to sell this model any longer