Kjemisk tørking: Biologisk prøvepreparering for skanning av elektronmikroskopi (SEM)

Overview

Skanning av elektronmikroskopi (SEM) er et kraftig verktøy for bilde – først og fremst – overflatefunksjonene i en biologisk prøve. Riktig prøveforberedelse er imidlertid avgjørende for å skaffe kvalitetsbilder. Denne videoen fokuserer på dehydrerings- og tørketrinnene for å forberede intakt voksen Drosophila for SEM.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Koon et al., Forberedelse av prokaryote og eukaryote organismer ved hjelp av kjemisk tørking for morfologisk analyse i skanning elektronmikroskopi (SEM), J. Vis. Exp. (2019).

1. Forberedelse og fiksering

1. Forbered Drosophila melanogaster (fruktflue).
   1. Bedøv voksne fluer ved hjelp av 100% karbondioksid. Plasser bedøvede voksne (ca. 10 til 30 fluer) i et lite hetteglass med skruehett i plast eller 1,5 ml sentrifugerør.
   2. Senk bedøvede fluer i 1 ml fikseringsmiddel (1,25% glutaraldehyd, 0,1 M fosfatbuffer pH 7,2) i 2 timer (eller over natten) ved 4 °C. Hvis fluene flyter til overflaten av fikseringsmiddelet, legg til noen dråper 2,5% polyetylenglykol tert-octylfenyl eter for å svekke overflatespenningen til fikseringsmiddelet som muliggjør total nedsenking av vevet. Fjern fikseringsmiddelet ved hjelp av en glasspipet.

2. Vask og dehydrering

1. Vask og dehydrer Drosophila melanogaster (fruktflue).
   1. Vask den faste prøven tre ganger med 1 ml 0,1 M fosfatbuffer pH 7,2 ved romtemperatur i 10 minutter i et 1,5 ml mikrosenterrør. Fjern hver vask med en glasspipette, vær forsiktig så du ikke fjerner fluene.
   2. Dehydrer prøven ved hjelp av en gradert etanolserie, i 10 minutter i et volum på 1 ml i et mikrofugerør. Etanolkonsentrasjonene er: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Fjern etanol med en glasspipette, vær forsiktig så du ikke fjerner fluene.
   3. Oppbevar prøven i 1,5 ml mikrosentrifugerøret med akkurat nok 100 % etanol til å dekke prøven før tørking.

3. Tørking

1. Utfør kjemisk tørking ved hjelp av heksametyldisilazan (HMDS).
   1. Bytt ut 100% etanoloppløsning med en 1:2-løsning av HMDS og 100% etanol i 20 minutter. Bytt ut 1:2-oppløsningen med en 2:1-løsning av HMDS og 100 % etanol i 20 minutter. Bytt ut 2:1-oppløsningen med 100 % HMDS i 20 min. Gjenta én gang.
      Merk: HMDS er brannfarlig og et akutt giftstoff (dermal rute). HMDS bør håndteres i en kjemisk avtrekkshette ved hjelp av passende personlig verneutstyr, inkludert hansker, labfrakk og øyebeskyttelse.
   2. Overfør prøven i HMDS, hvis den er i et 1,5 ml mikrosenterrør, til en veiefat i engangsaluminium. Når du er i veiefatet i aluminium, erstatt 100% HMDS med akkurat nok frisk 100% HMDS til å dekke prøven.
   3. Overfør prøven til en ikke-vakuumdesiccator av plast eller glass med fersk tørkemiddel (5-6 cm dyp) og plasser den i en kjemisk avtrekkshette. Alternativt kan du plassere prøven direkte i en kjemisk avtrekkshette for å tørke med et løst lokk, for eksempel en boks, for å forhindre at rusk faller på prøven. La prøven tørke i 12 til 24 timer.

4. Montering

1. Mount Drosophila melanogaster (fruktflue).
   1. Merk bunnen av monteringsstubben i aluminium for å angi hva som plasseres på toppen.
      Plasser de tørkede fluene i ønsket posisjon på lim eller karbonlimflik festet til toppen av en stubbe under et dissekerende mikroskop med presisjons pinsett.
   2. Påfør sølv ledende lim, dvs., sølvmaling, rundt de ytre kantene på stubbene. Koble sølvmalingen til fluene ved hjelp av en tannpirker for å sikre konduktivitet. Ikke la malingen berøre ønsket bildeområde.
   3. Plasser stubbene i en stubholderboks og plasser den åpne stubholderboksen i en desiccator. La sølvmalingen tørke minst 3 timer eller over natten for best resultat.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/	The company doesn't appear to sell this model any longer