Denne protokollen er et utdrag fra Koon et al., Forberedelse av prokaryote og eukaryote organismer ved hjelp av kjemisk tørking for morfologisk analyse i skanning elektronmikroskopi (SEM), J. Vis. Exp. (2019).
1. Forberedelse og fiksering
- Forbered Drosophila melanogaster (fruktflue).
- Bedøv voksne fluer ved hjelp av 100% karbondioksid. Plasser bedøvede voksne (ca. 10 til 30 fluer) i et lite hetteglass med skruehett i plast eller 1,5 ml sentrifugerør.
- Senk bedøvede fluer i 1 ml fikseringsmiddel (1,25% glutaraldehyd, 0,1 M fosfatbuffer pH 7,2) i 2 timer (eller over natten) ved 4 °C. Hvis fluene flyter til overflaten av fikseringsmiddelet, legg til noen dråper 2,5% polyetylenglykol tert-octylfenyl eter for å svekke overflatespenningen til fikseringsmiddelet som muliggjør total nedsenking av vevet. Fjern fikseringsmiddelet ved hjelp av en glasspipet.
2. Vask og dehydrering
- Vask og dehydrer Drosophila melanogaster (fruktflue).
- Vask den faste prøven tre ganger med 1 ml 0,1 M fosfatbuffer pH 7,2 ved romtemperatur i 10 minutter i et 1,5 ml mikrosenterrør. Fjern hver vask med en glasspipette, vær forsiktig så du ikke fjerner fluene.
- Dehydrer prøven ved hjelp av en gradert etanolserie, i 10 minutter i et volum på 1 ml i et mikrofugerør. Etanolkonsentrasjonene er: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Fjern etanol med en glasspipette, vær forsiktig så du ikke fjerner fluene.
- Oppbevar prøven i 1,5 ml mikrosentrifugerøret med akkurat nok 100 % etanol til å dekke prøven før tørking.
3. Tørking
- Utfør kjemisk tørking ved hjelp av heksametyldisilazan (HMDS).
- Bytt ut 100% etanoloppløsning med en 1:2-løsning av HMDS og 100% etanol i 20 minutter. Bytt ut 1:2-oppløsningen med en 2:1-løsning av HMDS og 100 % etanol i 20 minutter. Bytt ut 2:1-oppløsningen med 100 % HMDS i 20 min. Gjenta én gang.
Merk: HMDS er brannfarlig og et akutt giftstoff (dermal rute). HMDS bør håndteres i en kjemisk avtrekkshette ved hjelp av passende personlig verneutstyr, inkludert hansker, labfrakk og øyebeskyttelse.
- Overfør prøven i HMDS, hvis den er i et 1,5 ml mikrosenterrør, til en veiefat i engangsaluminium. Når du er i veiefatet i aluminium, erstatt 100% HMDS med akkurat nok frisk 100% HMDS til å dekke prøven.
- Overfør prøven til en ikke-vakuumdesiccator av plast eller glass med fersk tørkemiddel (5-6 cm dyp) og plasser den i en kjemisk avtrekkshette. Alternativt kan du plassere prøven direkte i en kjemisk avtrekkshette for å tørke med et løst lokk, for eksempel en boks, for å forhindre at rusk faller på prøven. La prøven tørke i 12 til 24 timer.
4. Montering
- Mount Drosophila melanogaster (fruktflue).
- Merk bunnen av monteringsstubben i aluminium for å angi hva som plasseres på toppen.
Plasser de tørkede fluene i ønsket posisjon på lim eller karbonlimflik festet til toppen av en stubbe under et dissekerende mikroskop med presisjons pinsett.
- Påfør sølv ledende lim, dvs., sølvmaling, rundt de ytre kantene på stubbene. Koble sølvmalingen til fluene ved hjelp av en tannpirker for å sikre konduktivitet. Ikke la malingen berøre ønsket bildeområde.
- Plasser stubbene i en stubholderboks og plasser den åpne stubholderboksen i en desiccator. La sølvmalingen tørke minst 3 timer eller over natten for best resultat.
