Kemisk torkning: Biologisk provberedning för scanning av elektronmikroskopi (SEM)

Overview

Scanning elektronmikroskopi (SEM) är ett kraftfullt verktyg för att avbilda – främst – ytegenskaperna i ett biologiskt prov. Korrekt provberedning är dock avgörande för att få kvalitetsbilder. Denna video fokuserar på uttorkning och torkning steg för att förbereda intakt vuxen Drosophila för SEM.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Koon et al., Förberedelse av prokaryota och eukaryota organismer med kemisk torkning för morfologisk analys vid scanningelektronmikroskopi (SEM), J. Vis. Exp. (2019).

1. Förberedelse och fixering

1. Förbered Drosophila melanogaster (fruktfluga).
   1. Söv vuxna flugor med 100% koldioxid. Placera sövda vuxna (ca 10 till 30 flugor) i en liten plastskruvlockflaska eller 1,5 mL centrifugerör.
   2. Sänk ner sövd fluga i 1 ml fixativ (1,25% glutaraldehyd, 0,1 M fosfatbuffert pH 7,2) i 2 timmar (eller över natten) vid 4 °C. Om flugorna flyter till ytan av fixativet, tillsätt några droppar 2,5% polyetylenglykol tert-oktylfenyleter för att försvaga ytspänningen hos fixativet vilket möjliggör total nedsänkning av vävnaden. Ta bort fixeringen med hjälp av en glasledning.

2. Tvätt och uttorkning

1. Tvätta och dehydrera Drosophila melanogaster (fruktfluga).
   1. Tvätta det fasta provet tre gånger med 1 ml 0,1 M fosfatbuffert pH 7,2 vid rumstemperatur i 10 min i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Ta bort varje tvätt med en glaspipett, var försiktig så att du inte tar bort flugorna.
   2. Dehydrera provet med hjälp av en graderad etanolserie i 10 minuter i en volym av 1 ml i ett mikrofugerör. Etanolkoncentrationerna är: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Ta bort etanolen med en glaspipett, var försiktig så att du inte tar bort flugorna.
   3. Förvara provet i mikrocentrifugröret på 1,5 ml med precis tillräckligt med 100 % etanol för att täcka provet före torkning.

3. Torkning

1. Utför kemisk torkning med hexamethyldisilazane (HMDS).
   1. Byt ut 100% etanollösningen mot en 1:2-lösning av HMDS och 100% etanol i 20 min. Byt ut 1:2-lösningen mot en 2:1-lösning av HMDS och 100% etanol i 20 min. Byt ut 2:1-lösningen mot 100% HMDS i 20 min. Upprepa en gång.
      Obs: HMDS är brandfarligt och ett akut toxin (hudväg). HMDS ska hanteras i en kemisk rökhuv med lämplig personlig skyddsutrustning inklusive handskar, labbrock och ögonskydd.
   2. Överför provet i HMDS, om det finns i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör på 1,5 ml, till en engångsskål av aluminiumvägning. En gång i aluminiumvägningsfatet, byt ut 100% HMDS med precis tillräckligt med färsk 100% HMDS för att täcka provet.
   3. Överför provet till en plast- eller glasavsugare utan vakuum med färskt torkmedel (5-6 cm djupt) och placera i en kemisk rökhuv. Alternativt kan du placera provet direkt i en kemisk rökhuv för att torka med ett löst lock, till exempel en låda, för att förhindra att skräp faller på provet. Låt provet torka i 12 till 24 timmar.

4. Montering

1. Mount Drosophila melanogaster (fruktfluga).
   1. Märk botten av aluminiummonteringsstubben för att indikera vad som placeras ovanpå.
      Placera de torkade flugorna i önskat läge på lim- eller kollimfliken som är fastsatt på toppen av en stub under ett dissekerande mikroskop med precisions pincett.
   2. Applicera silverledningande lim, dvs silverfärg,runt stubbens ytterkanter. Anslut silverfärgen till flugorna med en tandpetare för att säkerställa konduktivitet. Låt inte färgen vidröra önskat bildområde.
   3. Placera stubbarna i en stubhållarbox och placera den öppna stubhållarboxen i en desiccator. Låt silverfärgen torka minst 3 timmar eller över natten för bästa resultat.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/	The company doesn't appear to sell this model any longer