Este protocolo demonstra o registro em tempo real de relações completas de resposta a dose para ativação gpcr induzida por agonista a partir de uma única camada celular cultivada em um único microeletrodo usando medidas de impedância sem rótulo. O novo esquema de dosagem aumenta significativamente o throughput sem perda na resolução de tempo.
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Artigo de método
Protocolo de dosagem Stepwise para aumento do throughput em ensaios GPCR baseados em impedance sem rótulos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Ensaios baseados em impedância sem rótulos são cada vez mais usados para estudar contraato sinuoso ativado rGP em experimentos de cultura celular. A abordagem fornece monitoramento celular em tempo real com uma resolução de tempo dependente do dispositivo até várias dezenas de milissegundos e é altamente automatizada. No entanto, quando os números de amostra ficam altos (por exemplo, estudos de dose-resposta para várias ligas diferentes), o custo para as matrizes de eletrodos descartáveis, bem como a resolução de tempo disponível para gravações sequenciais bem-por-bem podem se tornar limitadoras. Portanto, apresentamos aqui um protocolo de adição agonista em série que tem o potencial de aumentar significativamente a produção de ensaios GPCR sem rótulos. Usando o protocolo de adição agonista serial, um agonista gpcr é adicionado sequencialmente em aumentar as concentrações em uma única camada celular enquanto monitora continuamente a impedância da amostra (modo agonista). Com essa abordagem serial, agora é possível estabelecer uma curva completa de resposta de dose para um agonista GPCR de apenas uma camada de célula única. O protocolo de adição agonista serial é aplicável a diferentes tipos de acoplamento GPCR, Gq Gi/0 ou Gs e é compatível com níveis de expressão recombinantes e endógenos do receptor em estudo. O bloqueio de receptores por antagonistas gpcr também é avaliado (modo antagonista).
Introdução
Este relatório apresenta uma descrição detalhada de um protocolo de adição serial desenvolvido para a quantificação da ativação do receptor acoplado por proteínaG induzida por ligand (GPCR) em células cultivadas aderentamente por medições de impedância sem rótulo. Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) estão envolvidos em uma infinidade de funções fisiológicas e doenças humanas1. Por causa disso e sua boa acessibilidade na superfície celular, os GPCRs são um dos alvos mais importantes de drogas. Esta avaliação se reflete em um número estimado de ~700 medicamentos aprovados visando GPCRs, equivalente a uma participação de ~35% em todas as ....
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Protocolo
1. Semeade celular em matrizes de eletrodos
NOTA: A seleção do layout do eletrodo é uma troca entre sensibilidade e número de células em estudo. Quanto menor o eletrodo, mais sensível é a medida, mas menor é o número de células em estudo. Para as células que mostram fortes flutuações de impedância ao longo do tempo em condições de linha de base, eletrodos maiores ou interdigitados são preferíveis.
- Pré-aqueça todas as soluções necessárias para a passagem e semeade padrão das células em um banho de água de 37 °C. Para ensaios com células U-373 MG humanas é preciso: salino tampão de fosfato (PBS) sem cálcio e magnésio, 0,05% (w/v) tr....
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Resultados
Um esquema típico para preparar as várias soluções agonistas é mostrado para um experimento usando matrizes de eletrodos de 8 poços com histamina como agonista nas tabelas 1-4. Tabela 1 e Tabela 2 apresentam volumes e concentrações para um experimento utilizando o modo de adição 1 (cf., Figura 1),enquanto a Tabela 3 e a Tabela 4 apresentam volumes e concentrações para um experimento seguindo.......
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Discussão
Este protocolo descreve um método para medições de impedância sem rótulos para determinar a relação de dose-resposta da ativação gpcr induzida por agonistas na ausência ou presença de antagonistas específicos para o mesmo receptor. A prova de conceito desse método foi apresentada em uma publicação recente12. Para nosso conhecimento, é o primeiro estudo descrevendo o estabelecimento de uma curva completa de resposta de dose da ativação GPCR mediada por agonistas usando uma única camada celular in v.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a Barbara Goricnick e Nadja Hinterreiter pela ajuda com o culturing celular e a preparação de soluções experimentais. Os autores reconhecem com gratidão o apoio financeiro do Grupo de Treinamento de Pesquisa 1910 Química medicinal de ligas seletivas do GPCR financiadas pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) o número de subvenção 222125149. Jas é particularmente grato por uma bolsa de estudos concedida pelo Programa de Igualdade de Gênero bávaro.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bü câmara de contagem rker | Marienfeld (Lauda-Kö nigshofen, Alemanha) | 640210 | |
| frascos de cultura de células 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Alemanha) | 690175 | |
| Incubadora de células (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Alemanha) | \ | |
| Centrífuga (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Alemanha) | \ | |
| Cloridrato de | difenidraminaSigma Aldrich (Taufkirchen, Alemanha) | D3630 | |
| Meio essencial mínimo de águia com 4,5 g/L de D-glicose e 2,2 g/L de NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Alemanha)Instrumento | D5671 | |
| (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, EUA) | \ | |
| Matrizes de eletrodos de 8 poços (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, EUA) | \ | Base PET com eletrodo de trabalho de 0,049 mm2 e eletrodo contador de ~50 mm2 (ouro) |
| Matrizes de eletrodos de 96 poços (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, EUA) | \ | Base PET com dois eletrodos (ouro) com 0,256 mm2 área total do eletrodo |
| Soro fetal de bezerro (FCS) | Biochrom (Berlim, Alemanha) | S0615 | |
| Cloridrato de histamina | Carl Roth (Karlsruhe, Alemanha) | 4017.1 | |
| Capela-fluxo laminar (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Alemanha) | 51022515 | gabinete de segurança classe II |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Alemanha) | 21083-027 | |
| L-glutamina | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Alemanha) | G7513 | |
| Micropipeta grande (100 - 1000 µ L) | Brandt (Wertheim, Alemanha) | 704780 | |
| Micropipeta grande (20 - 200 µ L) | Brandt (Wertheim, Alemanha) | 704778 | |
| Microscópio (contraste de fase, Nikon Diaphot) | Nikon (D & uuml; sseldorf, Alemanha) | ||
| Penicilina/estreptomicina | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Alemanha) | P0781 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Alemanha) | D8537 | |
| Pipeta, sorologia | Greiner bio-one (Frickenhausen, Alemanha) | 607 180 | |
| Pipetador (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Alemanha) | 26300 | |
| Tripsina | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Alemanha) | T4174 | em PBS com tubo EDTA de 1 mM |
| , 15 mL | de Greiner bio-one (Frickenhausen, Alemanha) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | de Greiner bio-one (Frickenhausen, Alemanha) | 210 261 | |
| células U-373 MG | ATCC (Rockville, MD, EUA) | ATCC HTB-17 | |
| banho-maria (TW21) | Julabo (Seelbach, Alemanha) | \ |
Referências
- Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
- Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.<....
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Reimpressões e permissões
