Summary
Detta protokoll visar realtidsregistrering av full dosresponsrelationer för agonist-inducerad GPCR-aktivering från ett enda cellskikt som odlas på en enda mikroelektrod med etikettfria impedansmätningar. Det nya doseringssystemet ökar avsevärt dataflödet utan förlust i tidslösning.
Abstract
Etikettfria impedansbaserade analyser används i allt högre grad för att icke-invasivt studera ligand-inducerad GPCR-aktivering i cellodlingsexperiment. Metoden ger cellövervakning i realtid med en enhetsberoende tidsupplösning ner till flera tiotals millisekunder och den är mycket automatiserad. Men när provsiffrorna blir höga (t.ex. dosresponsstudier för olika ligands) kan dock kostnaden för de engångselektrodmatriser som tillgänglig tidsupplösning för sekventiella well-by-well-inspelningar bli begränsande. Därför presenterar vi här ett seriellt agonistiskt tilläggsprotokoll som har potential att avsevärt öka produktionen av etikettfria GPCR-analyser. Med hjälp av det seriella agonistiska tilläggsprotokollet läggs en GPCR-agonist till sekventiellt i ökande koncentrationer till ett enda celllager samtidigt som provets impedans (agonistläge) kontinuerligt övervakar provets impedans (agonistläge). Med denna seriella metod är det nu möjligt att fastställa en full dos-responskurva för en GPCR-agonist från bara ett celllager. Det seriella agonisttilläggsprotokollet gäller för olika GPCR kopplingstyper, Gq Gi/0 eller Gs och det är kompatibelt med rekombinant och endogena uttrycksnivåer av receptorn som studeras. Receptorblockering av GPCR-antagonister är också bedömningsbar (antagonistläge).
Introduction
Denna rapport presenterar en detaljerad beskrivning av ett följetong tillägg protokoll som utvecklats för kvantifiering av ligand-inducerad G protein-kopplade receptor (GPCR) aktivering i adherentodlade celler genom etikett-fri impedans mätningar. G proteinkopplade receptorer (GPCRs) är involverade i en mängd fysiologiska funktioner och mänskliga sjukdomar1. På grund av detta och deras goda tillgänglighet på cellytan är GPCRs ett av de viktigaste läkemedelsmålen. Denna bedömning återspeglas i ett uppskattat antal ~ 700 godkända läkemedel som riktar sig till GPCRs, vilket motsvarar en ~ 35% andel på alla marknadsförda läkemedel2.
Utvecklingen av nya läkemedel omfattar två centrala processer: i) identifiering och funktionell karakterisering av biologiska målmolekyler, och (ii) upptäckten av nya blyämnen och deras utveckling till administrerade läkemedel. I båda processerna krävs effektiva metoder för att kvantitativt utvärdera interaktion mellan läkemedel och den efterföljande biologiska nedströmsreaktionen. Olika stadier av den prekliniska läkemedelsutvecklingsprocessen använder sig av olika analysmetoder, från biomolekylära interaktionsstudier mellan läkemedel och mål, över funktionella studier på celler i kultur, till experiment på struket organmaterial eller hela djur. Både fysiologisk betydelse och biologisk komplexitet ökar från den förra till de senare3. Även om det är det övergripande målet att minimera djurförsök, farmakologiska studier med hjälp av isolerade organ från försöksdjur eller till och med hela djur anses oundvikliga att omfattande karakterisera nya läkemedelskandidater. När det gäller analytisk avläsning ger organfarmakologistudier ett distala, integrativ "holistiskt" funktionellt svar av högsta fysiologiska relevans. En nackdel med sådana experiment är att de inte är förenliga med hög genomströmning screening av tekniska och etiska skäl och har till stor del ersatts av studier baserade på in vitro cell kultur4.
Metoder för att kvantifiera GPCR aktivering i cellkulturer inkluderar olika etikett-baserade kemiska analyser, som specifikt upptäcka andra budbärare, fosforylering tillstånd nedströms signalering proteiner, transkriptional aktivering via vissa transkriptionsfaktorer eller ligand-inducerad intracellulära receptortrafficking4,5. En nackdel med sådana etikettbaserade analyser är behovet av att märka cellerna med potentiellt skadliga färgämnen eller radioaktiva markörer. Detta kräver ofta att köra analysen som en slutpunkt-bestämning för en exponeringstid som måste anges a priori. Använda etikettbaserade endpoint analyser lider av denna mycket begränsade och partiska tidpunkten för experimentet och risken för att kemiska etiketter och sonder kan störa den vanliga cellfysiologin – potentiellt obemärkt av experimentören.
Under de senaste åren har etikettfria analyser för övervakning av GPCR-aktivering uppstått, som impedansbaserade tekniker eller optiska metoder som tillämpar resonansvågsgaller5,6. Märkning av cellerna krävs experimentellt inte med dessa metoder. Eftersom dessa fysiska avläsningar fungerar på låg amplitud signaler, sådana metoder anses icke-invasiva, de möjliggör kontinuerlig cellövervakning potentiellt i realtid och observationstiden begränsas endast av cellkulturen inte av avläsningen. I likhet med avläsningar från hela organ, etikett-fria metoder rapporterar vanligen om holistiska cellsvar, långt nedströms receptoraktivering när integration längs hela signalnätverket leder till tidsberoende men ganska ospecifika förändringar i cellmorfologi eller massomfördelning. Impedansbaserade analyser mäter den dielektriska signaturen av förändringar i cellform7,8,och mätningar med hjälp av resonant waveguide galler är känsliga för förändringar i brytningsindex vid cell-substrat gränssnitt som härrör från dynamisk massomfördelning (DMR)9. Den integrativ karaktär gör etikett-fria metoder extremt känsliga för receptormedierad händelser oavsett vilken typ (s) av G protein (Gq,Gi/0, Gs, G12/13) eller β-arrestin inblandade i signalkaskad6 och väl lämpad för endogena uttryck nivåer av receptorn.
I en standard etikett-fri impedans-baserad analys cellerna är adherently odlas i multi-well plattor med coplanar guld-film elektroder deponeras på botten av varje brunn10. Dessa elektrodarrayer är anslutna till en impedansanalysator och cellsvaren på en experimentell stimulans registreras från individuella brunnar genom tidslösta impedansavläsningar. I en typisk GPCR analys en ligand läggs i individuellt olika koncentrationer till varje individ väl. De ligand-inducerad förändringar i impedans tidkursen analyseras sedan med avseende på karakteristiska kurva funktioner såsom maximal signalförändring, område under kurvan, signalförändring inom ett givet tidsintervall eller lutning av kurvan vid en viss tidpunkt, för att kvantifiera ligand en potens och effekt11.
Kostnaden för elektrodmatriserna kan begränsa tillämpningen av denna teknik i hts-kampanjer (High Genomströmning). Dessutom ökar antalet enskilda mätningar och minskar därmed den tillgängliga tidsupplösningen för varje brunn gradvis - även för toppmoderna flerkanalsinspelningar. Under sådana förhållanden kan snabba och tillfälliga cellsvar undgå mätningen. Dessutom innebär den konventionella enbrunnen – en koncentrationsmetod en betydande tids- och kostnadsfaktor för perfunderas organ-on-chip eller body-on-chip-utveckling med avseende på deras lämplighet i ligand-GPCR interaktionsanalys.
Av denna anledning utvecklade vi en stegvis dosering protokoll som möjliggör registrering av full dos-respons kurvor av ligand-inducerad GPCR aktivering i odlade cell monolayers genom att kontinuerligt övervaka impedans av en enda brunn medan den agonistiska koncentrationen ökar stegvis. Det seriella agonisttilläggsprotokollet ökar signifikant dataflödet per brunn från en koncentration till 10 eller fler koncentrationer, vilket visas på det aktuella exemplet på mänskliga U-373 MG-celler, som endogenöst uttrycker histamin 1-receptorn (H1R). Metoden har således potential att avsevärt förbättra dataflödet i etikettfria dosresponsstudier, medan tidsupplösningen behålls vid det instrumentella högsta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellsådd på elektrodarrayer
OBS: Val av elektrodlayout är en avvägning mellan känslighet och antal celler som studeras. Ju mindre elektroden, desto känsligare är mätningen men det mindre är antalet celler som studeras. För celler som visar starka impedansfluktuationer över tiden under baslinjeförhållanden är större eller interdigerade elektroder att föredra.
- Förvärma alla lösningar som behövs för standard cell passaging och sådd i en 37 ° C vattenbad. För analyser med mänskliga U-373 MG-celler det tar: fosfat buffrad saltlösning (PBS) utan kalcium och magnesium, 0,05% (w / v) trypsin, cell odling medium (Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) kompletteras med 5% (v /v) fetala kalv serum (FCS), 2 mM L-glutamin och 100 μg/ml penicillin/streptocin).
- Skölj lagerkulturens cellskikt som odlas på botten av konventionella cellodlingsflaskor eller diskar med PBS två gånger.
- Ta bort PBS, tillsätt trypsin-lösningen (1 ml för 25 cm2)och låt cellerna ruva vid 37 °C i 5 min (gäller U-373 MG-celler).
- Kontroll för fullständig avskildhet av cellerna från botten av tillväxtsubstratet genom mikroskopi.
- Stoppa trypsin reaktionen så snart cellerna är helt fristående genom att lägga till 9 ml cellodlingmedium per 1 ml trypsin till cellsuspensionen. Skölj noggrant återstående celler från botten av cellodlingssubstratet genom att pipetta upphängningen över substratet.
- Samla cellsuspensionen med ett pipett och överför den till ett centrifugeringsrör (15 ml eller 50 ml-rör).
- Snurra ner cellerna genom centrifugering vid 110 x g i 10 min vid rumstemperatur.
- Ta försiktigt bort supernatanten och återhäng försiktigt cellpelleten i odlingsmediet innan du räknar cellerna (t.ex. genom att använda en hemacytometer för faskontrastmikroskop och manuell räkning).
- Justera cellsuspensionen till önskad celldensitet. För experiment med U-373 MG-celler, använd 100 000 celler/cm2 för att odla ett konfluenttcelllager inom 48 h. Detta översätter till en celldensitet på 200 000 celler/ml för 8-brunnselektrodarrayer med ett tillväxtområde på ~0,8 cm2 och en brunnsvolym på 400 μL.
OBS: För reproducerbara GPCR aktiveringexperiment, celler bör odlas till confluent monolayers på elektrod arrayer. För att säkerställa korrekt receptoruttryck på cellytan bör cellerna sås minst 36 timmar innan experimentet utförs. Testning av olika celltätheter för cellsådd är ofta meningsfullt att identifiera de bästa experimentella förhållandena. - Tillsätt cellfjädringen i elektrodmatrisens brunnar och låt säljarna bosätta sig i rumstemperatur i 10– 15 min för att säkerställa homogen fördelning av celler på botten av brunnarna.
- Odla celler för minst 36 timmar i en vanlig cellkulturinkubator med 5% CO2 (beroende på medeltyp) vid 37 °C och fuktad atmosfär. Ändra cellodlingsmedium 24 h före experimentet.
- På experimentdagen inspekterar du celllagren på elektrodmatriserna genom (faskontrast) mikroskopi för att säkerställa fullständig täckning av elektroder med celler.
2. Jämvikt av celler i serumfritt medium
- Förvarm serumfritt medium, i denna studie: Leibovitz L15 medium.
- Ta bort cellodlingsmedium från celler som odlas på elektrodarrayer och byt ut genom förvärmt serumfritt medium. Använd 200 μL för 8-brunnsbaserade elektrodmatriser och 150 μL för 96-brunnselektrodmatriser.
- Låt cellerna jämvikta i serumfritt medium vid 37 °C i minst 2 timmar. Jämviktstiden beror starkt på celltypen. Till exempel, U-373 MG celler behöver 2 h, CHO celler behöver 4 h, BAEC kan kräva över natten jämvikt i L-15 medium.
OBS: L-15 medium är CO2 oberoende och kräver en CO2-friatmosfär. För jämvikt i L-15 ställa in inkubatorn till 0 % CO2. Jämvikt kan övervakas av impedansavläsningar, vilket vi rekommenderar att göra för de första experimenten.
3. Övervakning av celljämvikt med impedansavläsningar
- Placera elektrodmatrisen i den anslutande matrishållaren på impedansanalysatoren.
- Se till att korrekt låg impedanskontakt mellan elektroder och impedansanalysator. Denna kontroll är individuellt annorlunda för olika instrument.
OBS: Om instrumentet inte gör anslutningen till elektroderna, öppna kontaktklämman igen, justera elektrodmatrisen för korrekt placering inuti hållaren och försök igen. - Välj elektrodtyp och/eller multibrunnsformat från programvarans användargränssnitt.
- Ställ in mätparametrarna. Olika alternativ finns tillgängliga.
OBS: För att välja den mest känsliga AC-frekvensen hänvisar vi till litteratur- och instrumenthandböckerna eftersom det beror på elektrodlayout och celltyp som studeras. Vanligtvis är avsenningsfrekvensen i intervallet 4 kHz – 50 kHz. Här odlades U-373 MG-celler på cirkulära arbetselektroder med en diameter på 250 μm och de övervakades med en AC-frekvens på 12 kHz.- Om det finns lägen för insamling av enstaka och flera frekvensfrekvensdata är tillgängliga väljer du ett frekvensläge för att säkerställa maximal tidsupplösning. Mätningen kommer att utföras vid denna enda frekvens. För de mest spridda instrumenten finns ett antal förinställda frekvenser längs det tillgängliga frekvensfönstret.
- Om antalet brunnar som studeras är lågt eller tidsupplösningen inte är kritiskt väljer du flera frekvensinspelningar i stället. Impedansavläsningar vid ett visst antal frekvenser kommer att registreras för varje brunn för senare djupgående analys.
TIDsupplösningen minskar med ökande antal frekvenser som registrerats per brunn och ökande antal brunnar. Alternativen för val av frekvens- och datainsamlingsläge varierar beroende på instrumenttyp och version.
- Starta förvärv av tidskursdata.
- Följ cellskiktets impedans (minst 2 h) tills impedansen har stabiliserats. Under tiden, förbereda agonist lösningar.
- När celllagren har nått en stabil impedansnivå, antingen (i) gå vidare till seriellt agonistiskt tillägg inom samma experiment eller (ii) avsluta datainsamling och starta en ny datauppsättning för övervakning av agonist-inducerad receptoraktivering.
4. Förberedelser av agonistiska lösningar för experiment i agonistläge
- Beräkna koncentrationen av agonistiska lösningar efter behov för varje steg av seriell dosering enligt ekvation (1). n varierar från 1 till det totala antalet serietillägg i. x betecknar koncentration och volym i brunnen i steg n. y betecknar koncentration och volym av "lösning-till-till-läggas" i steg n.
Obs: Tänk på antalet replikat och beräkna den totala volymen "lösning-till-läggas till" för varje koncentrationssteg. Resultat av en typisk beräkning anges i tabellerna 1-4. Det krävs en allmän uppfattning om det agonistiska koncentrationsområde som ska studeras eftersom intervallet definierar koncentrationeroch antal portioner som ska administreras under serietillägg. Med hjälp av det seriella agonistiska tilläggsprotokollet ökar den agonistiska koncentrationen stegvis. Därför måste mängden agonist redan i brunnen när nästa dos tillsätts beaktas. När antalet agonistiska molekyler som redan finns i brunnen är nx = cx ≥Vx (med den nuvarande koncentrationen cx och volym Vx)och antalet molekyler i brunnen efter nästa tillägg är nx +y, antalet molekyler som skall läggas till ny bestäms av koncentrationen cy och volym Vy av lösningen som skall tillämpas på brunnen (ny = cy ≥ Vy). Efter att ha lagt till en del agonist, den nya mängden agonist molekyler i brunnen är: cx + y ≥ V x +y = cx ≥ Vx + cy ≥ Vy. Den här beräkningen gäller för varje efterföljande steg. På grund av det ömsesidiga beroendet av agonistisk koncentration i brunnen och mängden agonist i de delar som skall läggas till med varje steg, är det viktigt att definiera slutliga koncentrationer efter varje steg i förväg.
Läge 1: Brunnen ökar med varje steg som vätska kontinuerligt tillsätts.
Använd Vx1 = 200 μL och Vy1 .... Vyi = 30 μL med hjälp av det här läget och ett 8-brunnsformat.
Läge 2: Volymen i brunnen är konstant eftersom volymen läggs till med varje steg tas bort strax före det efterföljande tillägget.
Använd Vx1 = 150 μL och Vy1 .... Vyi = 75 μL med hjälp av detta läge och ett 96-brunnsformat.
- Skriv ut databladet med den totala volymen per koncentration och detaljerade instruktioner för rörledningar.
- Förbered alla lösningar i det belopp som krävs. Gör alla agonistiska lösningar i samma serumfria medium som används för att jämställa cellerna.
VARNING: Histamindihydrochloride anses vara farlig enligt 2012 OSHA Hazard Communication Standard (29 CFR 1910.1200). Histamin orsakar hudirritation, allvarlig ögonirritation, kan orsaka en allergisk hudreaktion, allergi, astmasymtom eller andningssvårigheter om inandning och kan orsaka irritation i luftvägarna. Tänk på säkerhetsdatabladet.
OBS: Gör agonistiska lösningar så fräscha som möjligt. Stabiliteten hos agonister i lösning kan variera avsevärt. Förvara lösningar vid 4 °C eller lägre tills de används i experimentet. För vissa molekyler ytterligare stabiliseratillsatser, som BSA när du använder peptid-baserade eller lipid-baserade molekyler, kan övervägas för att förhindra adsorption till väggarna i brunnar och rör. - Om du utför experimentet i 96-brunnsformat, överföra lösningar till en konventionell 96-brunnsplatta (inga elektroder) och använd en 8- (eller 12-) kanalrör för snabb vätskeöverföring till elektrodmatrisen.
5. Förberedelse av agonistiska lösningar för experiment i antagonistläge
OBS: Förbered antagonistlösningen med den koncentration som ska appliceras i hela. Volym och koncentration av antagonistlösning beror på läget för agonistisk tillsats (1 eller 2). Exempel för experiment i 8-brunn eller 96-brunnformat i tilläggläge 2: (A) 8-brunnformat (Vx1 = 200 μL, VAntagonist = 200 μL); (B) 96-brunnsformat (Vx1 = 150 μL, VAntagonist = 75 μL).
- Beräkna koncentrationen av varje agonistlösning som behövs för varje steg i seriedosering enligt beskrivningen i steg 4.1.
- Gör alla agonistiska lösningar i samma serumfria medium som används för att jämställa cellerna och tillsätt antagonisten vid samma slutliga koncentration som planerat för respektive brunnar i experimentet.
OBS: I detta fall histamin lagerlösning (10 mM) är beredd i L-15 medium. När agonister löses upp i andra lösningsmedel (t.ex. dimetylsulfoxid (DMSO), etanol) bör en lösningsmedelskontroll inkluderas för att ta hänsyn till den ökande lösningsmedelsbelastningen vid varje steg.
6. Utföra det seriella tilläggsprotokollet i agonistläge
- Starta datainsamling enligt beskrivningen i steg 3.1 – 3.5.
- Förvärm de agonistiska lösningarna före användning genom att placera dem i inkubatorn ca 10 – 15 min före tillägg.
OBS: Vid användning av termo-labile ämnen bör lösningarna inte hållas vid 37 °C för länge. Om förvärmningen i 10 –15 min anses vara kritisk, ta med lösningar på 37 °C strax före tillsats i ett vattenbad. - Kör den agonistiska seriedoseringen beroende på det valda additionsläget. Följande läge 1 ökar den totala volymen i brunnen med varje tillägg av nästa dos. I läge 2 tas samma volym som läggs till med varje steg också bort igen precis innan du lägger till nästa högre dos.
OBS: Tid som behövs för att jämlägga celllagret mellan två efterföljande agonistiska doser beror på cellernas svarstid. Ett första experiment i parallellt läge (en brunn – en koncentration) avslöjar (i) cellresponstider för olika agonistiska koncentrationer och (ii) den känsligaste kurvanparametern (t.ex. impedanshögsta, impedans efter tid x).
A: Läge 1 / 8-brunnformat
- Tillsätt 30 μl av den första lösningen med den lägsta koncentrationen av agonist till de celler som var jämvikta i 200 μL serumfritt medium.
- Låt cellerna reagera och jämvikta under den fördefinierade tidsperioden (t.ex. 15 min).
- Tillsätt 30 μL av den andra lösningen med nästa högre koncentration.
- Upprepa steg 6.3.1-6.3.3 med den tredje, fjärde och så vidare, agonistiska lösningen.
OBS: Arbeta med 10 koncentrationssteg kommer att resultera i en total volym på 500 μL i slutet av experimentet, vilket är strax under den maximala tillämpliga volymen av dessa brunnar på ~ 550 μL.
B: Läge 2 / 96-brunnformat
OBS: Pausa datainsamlingen under varje vätskehanteringssteg (addition/removal) via impedansinstrumentets programvara när du kör experiment i 96-brunnsformat. Den mer genomarbetade vätskehanteringen kan störa datainsamlingen. Använd en flerkanalspipett.
- Pausa datainsamlingen.
- Tillsätt 75 μl av den första lösningen med den lägsta koncentrationen av agonist till de celler som var jämvikta i 150 μL serumfritt medium.
- Återuppta datainsamlingen.
- Låt cellerna reagera och jämvikta under den fördefinierade tidsperioden (t.ex. 15 min).
- Ca 1 – 2 min innan den ordinarie jämviktstiden slutar, pausa mätningen och ta bort 75 μL från varje brunn.
OBS: Den tidpunkt då lösningen ska tas bort beror på antalet brunnar som övervakas parallellt och rörhastigheten. Den tid som behövs för att ta bort lösningarna bör inte överstiga tiden mellan efterföljande steg. - Tillsätt 75 μL av den andra lösningen med nästa högre koncentration och återuppta mätningen.
- Upprepa steg 6.3.8-6.3.10 med den tredje, fjärde och så vidare, agonistiska lösningen.
7. Utföra det seriella tilläggsprotokollet i antagonistläge
- Starta mätningen enligt beskrivningen i steg 3.1 – 3.5.
- Vid jämvikt av cellskikten, förbered antagonistlösning (t.ex. 200 μL av 1,5 μM diphenhydramine hydrochlorid i L15 medium).
VARNING: Difenhydraminhydroklorid har potentiella akuta hälsoeffekter. Det är skadligt vid sväljning eller inandning, kan orsaka ögon- och hudirritation. Det kan orsaka irritation i luftvägarna och mag-tarmkanalen. Tänk på säkerhetsdatabladet. - Förvärma antagonisten och agonistiska lösningar genom att placera dem i inkubatorn ca 10 - 15 min före tillägg till cellkulturer (se. 6.2). Om antagonistfria brunnar ingår i analysen också, även förvarm serumfritt medium.
- Lägg till antagonistlösningen i de angivna brunnarna. Låt cellerna jämvikta med antagonist i 15 – 20 min. Om antagonistfria brunnar ingår, tillsätt samma volym serumfritt medium till dessa brunnar.
- Enligt antagonisttillägg i läge 2, ta bort lösningen från brunnarna
(A) Format på 8 brunnar (200 μL)
(B) 96-brunnsformat (75 μL) - Kör den agonistiska additionssekvensen enligt beskrivningen i steg 6.3.
8. Export och analys av data
- Exportera data med hjälp av impedansinstrumentets programvara för att konvertera alla inspelade data från proprietära till gemensamma dataformat (t.ex. csv). Det här steget möjliggör data omorganisation och presentation med andra programpaket.
- Ladda de csv-formaterade data till vetenskapliga dataanalysprogram.
- Normalisera impedansvärden genom att subtrahera impedansen för den sista datapunkten före det första tillägget av agonistisk lösning och genom att ställa in tiden för tillägg till t = 0. Rita tidsförloppet av normaliserad impedans.
- Rita de individuella tidskurserna och identifiera maxima i impedans efter varje tilläggsteg. Komponera ett datablad med dessa värden.
- Rita värdena för maximalt (eller minimum, om tillämpligt) impedansförändringar som en funktion av agonistisk koncentration. Detta kan göras för individuella brunnar eller för medelvärdena (medelvärde ± SD).
- Använd en datapassningsrutin för att bestämma halvmaximaleffektiva koncentrationer (EC50) och maximalt svar (EMax)med hjälp av den fyra parametrarnas logistikmodell (ekvation 2):
OBS: c anger den agonistiska koncentrationen, A1 är minst och A2 är den maximala asymptot en sigmoidal dos-responskurva(A2 = EMax). EG50 är koncentrationen vid böjningspunkten i kurvan, och n motsvarar Hill sluttningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett typiskt system för att förbereda de olika agonistiska lösningar na visas för ett experiment med 8-brunnselektrodarrayer med histamin som agonist i tabellerna 1-4. Tabell 1 och tabell 2 presenterar volymer och koncentrationer för ett experiment med tilläggsläge 1 (jfr., figur 1), medan tabell 3 och tabell 4 uppvisar volymer och koncentrationer för ett experiment efter additionsläge 2 (se bild 1). Data har beräknats med ekvation (1).
Ett representativt experiment visas i figur 2 för konfluenta lager av U-373 MG-celler, som endogenöst uttrycker histamin 1-receptorn, som odlas på en 8-brunns elektrodarray med en fungerande elektrod av 250 μm diameter med histamin som agonist. Mätningen utfördes med en enda frekvens på 12 kHz. Tillägg av den agonistiska koncentrationsserien utfördes efter läge 1. I det valda experimentet 10 lösningar med ökande histamin koncentration (beredd enligt steg 4) lades sekventiellt var 15 min(figur 2A). Det seriella doseringssystemet tillämpades på sju av åtta brunnar. I ett väl agonistiskt fritt medium (L-15) lades sekventiellt som en negativ kontroll i nio av tio steg. Det sista tillskottet till denna kontroll var en histaminlösning som gav en slutlig koncentration på 100 μM histamin i brunnen. Data har ritats med dataanalysprogramvara och visas som impedansändring Δ| Z| 12 kHz / kΩ längs experimentet, med impedansförändringen och tidspunkten för det första tillägget är inställd på noll. Den första jämviktstiden i den experimentella bufferten på 2 h visas inte i denna tomt. Tidspunkterna för agonistiskt tillägg indikeras av pilar.
Förändringen i impedans i förhållande till baslinjen efter att varje koncentrationssteg extraherats från kurvorna med hjälp av en datamarkör. Vid steg utan klart maximalt användes den sista datapunkten innan nästa tillägg användes för analys. Impedansändringar Δ| Z| 12 kHz ritades som en funktion av histaminkoncentration (cx+y)(figur 2B,symboler). Överföringsfunktionen för en logistisk modell med fyra parametrar (jfr steg 8.6) monterades på de experimentella datapunkterna från sju brunnar(figur 2B,linjer). Passformsresultaten visas i tabell 5. Figur 2C och figur 2D visar resultatet av att uppgifterna i genomsnitt är i genomsnitt i figur 2A och figur 2B,med medelvärde ± SD för sju brunnar. Genomsnittliga tidskursdata sammanfattas i figur 2C, medan den genomsnittliga dos-responskurvan finns i figur 2D.
I dosresponsförhållanden enligt figur 2B,Dtillämpades monteringsproceduren på hela koncentrationsområdet som returnerade EC50 = (0,86 ± 0,13) μM. Impedanssvaret ökar monotoniskt med ökande histaminkoncentration med undantag för de två sista koncentrationsstegen (30 μM, 100 μM slutlig koncentration). Detta svar förklaras förmodligen av nedreglering av histaminreceptorn, desensibilisering eller överstimulering av cellerna (se diskussion). För att ta hänsyn till denna effekt har dataintervallet för analys minskat, vilket visas för ett enda seriellt doseringsexperiment (figur 3, ja 1) som valts ut från de data som visas i figur 2. Att ställa in den nedre asymptoten(A1)till noll under minsta kvadratoptimering förutsatt att ingen impedansförändring som svar på 0 μM histamin är väl motiverat. Tillämpa denna tre parameteroptimering ger en EC50 av (0,75 ± 0,12) μM (jfr., figur 3B). EG50-värdena konstaterades vara okänsliga för något av dataanalyslägena och var inte signifikant annorlunda.
Typiska resultat för ett 96-brunnsplattexperiment sammanfattas i figur 4. U-373 MG celler odlades på 96-brunn elektrod arrayer som beskrivs ovan. 32 brunnar ingick i mätningen. 8 brunnar fungerade som agonistfria kontroller, exponeras för medium endast. 24 brunnar utsattes för en rad ökande histaminkoncentrationer beräknade och förberedda för additionsläge 2. Tidsförloppet för impedansförändring visas för alla 32 individuella brunnar i figur 4A. En av kurvorna (markerade i rött) visar en ovanlig tidskurs och uteslöts från vidare analys. Data från 23 brunnar var därför i genomsnitt och ritades som tidsförlopp för genomsnittlig impedansförändring (medelvärde ± SD) i figur 4B. Varje enskild kurva analyserades enligt beskrivningen ovan för dos-respons förhållandet. Datapunkter var i genomsnitt och ritades som funktion av den slutliga histaminkoncentrationen(figur 4C). Dosresponsdata analyserades med hjälp av den fyra parametrar logistiska modellen, som returnerade ett genomsnittligt EG50-värde på (1,0 ± 0,3) μM.
Ett typiskt resultat för det seriella agonisttilläggsprotokollet i antagonistläge visas i figur 5. Här var en brunn förbehandlad med 0,75 μM av histaminreceptorantagonisten diphenhydramine (röd kurva) 20 min innan den första histaminen lades till (figur 5A). Kontrollen fick antagonistfritt medium (blå kurva). Antagonisten tillsattes efter läge 2, vilket innebär att 200 μL av de slutligen 400 μL togs bort innan agonistserien tillämpades. Agonist (histamin) lades till efter seriell doseringsläge 1 enligt beskrivningen i exemplen ovan. Det är viktigt för experiment i antagonistläge att antagonistkoncentrationen hålls konstant under hela experimentets tid. Därför måste alla agonistiska lösningar som läggs till brunnen också innehålla den fördefinierade antagonistkoncentrationen (i detta fall 0,75 μM), medan kontrollen förblir antagonistfri. En antagonistisk effekt blir uppenbar genom en "fördröjd" ökning av impedans inom det seriella doseringssystemet som motsvarar högre agonistiska koncentrationer som behövs för att framkalla ett cellsvar. I dos-respons förhållandet effekten av antagonisten uttrycks som en högerförskjutning av kurvorna, vilket motsvarar en ökning av EG50, förutsatt att antagonisten är en konkurrenskraftig ligand i förhållande till agonist (figur 5B). EG50 fastställdes till (0,92 ± 0,05) μM i avsaknad av antagonisten och (14,7 ± 0,6) μM i dess närvaro.
Bild 1: Seriella fortisttillägglägen. (A)Schematiska illustrerar koncentrationsberäkningar. Genom att lägga agonist lösning av koncentration cy och volym Vy till en brunn med volym Vx och agonist koncentration cx,ökar volymen till Vx + y och koncentrationen ökar till c x +y. (B)Två olika lägen för seriellt agonistiskt tillägg. Läge 1: Den totala volymen i brunnen Vx+y ökar med varje tillägg. Läge 2: Den volym som läggs till vid varje koncentrationssteg tas bort igen innan nästa dos tillsätts, vilket håller den totala volymen i brunnskonstanten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Resultat av ett typiskt experiment i 8-brunnsformat. (A)Tidsförloppet för impedansbyte vid 12 kHz för cellskikt en av u373 MG-cellskikt som odlas på cirkulära arbetselektroder med en diameter på 250 μm. I sju av åtta brunnar seriella tillägg av histamin tillämpades. En brunn (grå kurva) var sekventiellt laddad med histaminfri buffert vid varje steg (läge 1), med undantag för det sista steget när 100 μM histamin lades till som en positiv kontroll. (B)Dosresponsförhållanden som genereras från den maximala impedansändringen i förhållande till baslinjen för sju individuella brunnar efter varje koncentrationssteg. (C)Genomsnittlig tidsförlopp för impedansförändring (medelvärde ± SD) som genereras från sju individuella brunnar enligt (A). (D)Genomsnittliga dosresponsrelationer som genereras från enskilda datamängder enligt (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Anpassning av dataanalyslägen. (A)Typisk tidskurs för impedansbyte vid 12 kHz för ett enda confluent U-373 MG-cellskikt som odlas på cirkulära arbetselektroder med 250 μm diameter. (B) Experimentell dosresponsförhållande (fyllda symboler) som genereras från den maximala impedansändringen i förhållande till baslinjen efter varje koncentrationsökning. Antingen hela datauppsättningen utsattes för monteringsproceduren (svart och grå kurva) eller den sista datapunkten - som anger uppkomsten av receptoravsensibilisering och/eller internalisering - utelämnades från kvantitativ analys (röd och magentakurva). Alla fyra parametrarna justerades under minst kvadratisk optimering (svart och röd kurva) eller parametern A1, som representerar den nedre asymptoten, sattes in och fastställdes till noll (grå och magentakurva). EG50-värdena var inte signifikant annorlunda för de två dataanalyslägena. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Typiskt experiment i 96-brunnsformat. (A)Tidsförloppet för impedansförändring mätt på 12 kHz för confluent U-373 MG-celllager som odlas på en 96-brunnelektrodarray. Data visas för 32 brunnar. 24 brunnar utsattes för en rad ökande histaminkoncentrationer som tillsatts med en jämviktstid på 15 min mellan varje steg. Kurvan som markerades i rött uteslöts från genomsnitt. Åtta brunnar (kontroll) behandlades med histaminfritt medium vid varje tidpunkt av tillägg. (B)Tidsförloppet för genomsnittlig impedansförändring för 23 individuella brunnar som svar på histamin serietillägg och åtta kontrollbrunnar som visas i (A). (C)Genomsnittligt dosresponsförhållande som genereras från den maximala impedansförändringen i förhållande till baslinjen efter varje koncentrationsökning (medelvärde ± SD). Data var utrustade med en logistisk funktion med fyra parametrar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: Typiskt experiment i antagonistläge. (A)Tidsförlopp för impedansförändring vid 12 kHz för confluent U-373 MG-cellskikt som odlas på cirkulära arbetselektroder med 250 μm diameter vid tillsats av ökande koncentrationer av histamin med eller utan närvaro av histaminreceptorantagonistdifenhydramin. Diphenhydramine (0,75 μM) eller antagonistfritt medium (L15) lades till 20 min innan den agonistiska seriedoseringen startade. (B)Dosresponsrelationer som genereras från den maximala impedansändringen i förhållande till baslinjen efter varje koncentrationsökning från data som visas i (A). Närvaron på 0,75 μM Diphenhydramine ökade EC50 från (0,92 ± 0,05) μM till (14,7 ± 0,6) μM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Lösning # | cx+y (μM) | cx (μM) | Vx (μL) | Vx+y (μL) | Vy (μL) | cy (μM) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 230 | 30 | 0.08 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 230 | 260 | 30 | 0.79 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 260 | 290 | 30 | 2.03 |
| 4 | 1 | 0.3 | 290 | 320 | 30 | 7.77 |
| 5 | 3 | 1 | 320 | 350 | 30 | 24.33 |
| 6 | 10 | 3 | 350 | 380 | 30 | 91.67 |
| 7 | 30 | 10 | 380 | 410 | 30 | 283.33 |
| 8 | 100 | 30 | 410 | 440 | 30 | 1056.67 |
Tabell 1: Koncentrationsberäkningsschema för experiment med 8-brunnselektrodmatriser efter additionsläge 1.
| Lösning # | cy (μM) | Vy (μL) | göra från | c (μM) | Utspädningsfaktorn | göra totalt V (μl) | användning (μl) | lägg till V (μl) |
| 1 | 0.08 | 30 | 3 | 2.03 | 26.52 | 600 | 22.6 | 577.4 |
| 2 | 0.79 | 30 | 4 | 7.77 | 9.83 | 600 | 61 | 539 |
| 3 | 2.03 | 30 | 5 | 24.33 | 11.97 | 600 | 50.1 | 549.9 |
| 4 | 7.77 | 30 | 6 | 91.67 | 11.8 | 600 | 50.8 | 549.2 |
| 5 | 24.33 | 30 | 7 | 283.33 | 11.64 | 600 | 51.5 | 548.5 |
| 6 | 91.67 | 30 | 8 | 1056.67 | 11.53 | 600 | 52.1 | 547.9 |
| 7 | 283.33 | 30 | 8 | 1056.67 | 3.73 | 600 | 160.9 | 439.1 |
| 8 | 1056.67 | 30 | 10 mM Lager | 10000 | 9.46 | 800 | 84.5 | 715.5 |
Tabell 2: Pipetting schema för experiment med 8-brunn elektrod arrayer efter additionläge 1.
| Lösning # | cx+y (μM) | cx (μM) | Vx (μL) | Vx+y (μL) | Vy (μL) | cy (μM) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 400 | 200 | 0.02 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 200 | 400 | 200 | 0.19 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 200 | 400 | 200 | 0.5 |
| 4 | 1 | 0.3 | 200 | 400 | 200 | 1.7 |
| 5 | 3 | 1 | 200 | 400 | 200 | 5 |
| 6 | 10 | 3 | 200 | 400 | 200 | 17 |
| 7 | 30 | 10 | 200 | 400 | 200 | 50 |
| 8 | 100 | 30 | 200 | 400 | 200 | 170 |
Tabell 3: Koncentrationsberäkningsschema för experiment med 8-brunnselektrodmatriser efter additionsläge 2.
| Lösning # | cy (μM) | Vy (μL) | göra från | c (μM) | Utspädningsfaktorn | göra totalt V (μl) | användning (μl) | lägg till V (μl) |
| 1 | 0.02 | 200 | 3 | 0.5 | 25 | 1000 | 40 | 960 |
| 2 | 0.19 | 200 | 4 | 1.7 | 8.95 | 1000 | 111.8 | 888.2 |
| 3 | 0.5 | 200 | 5 | 5 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 4 | 1.7 | 200 | 6 | 17 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 5 | 5 | 200 | 7 | 50 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 6 | 17 | 200 | 8 | 170 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 7 | 50 | 200 | 8 | 170 | 3.4 | 1000 | 294.1 | 705.9 |
| 8 | 170 | 200 | 200 μM Lager | 200 | 1.18 | 1300 | 1105 | 195 |
Tabell 4: Pipettingschema för experiment med 8-brunnselektrodmatriser efter additionsläge 2.
| Väl | EG50 | Emax (=A2) | A1 | N |
| (μM) | (kΩ) | - Jag vet inte vad du ska göra. | ||
| 1 | 0,9 ± 0,1 | 1680 ± 70 | 150 ± 80 | 1,9 ± 0,5 |
| 2 | 0,7 ± 0,2 | 1770 ± 90 | 200 ±140 | 1,3 ± 0,4 |
| 3 | 0,6 ± 0,2 | 1700 ± 100 | 60 ± 250 | 1,1 ± 0,5 |
| 4 | 0,6 ± 0,2 | 2000 ± 100 | 140 ± 180 | 1,3 ± 0,4 |
| 5 | 0,9 ± 0,1 | 1810 ± 60 | 160 ± 80 | 1,4 ± 0,3 |
| 6 | 0,8 ± 0,1 | 1950 ± 70 | 200 ± 110 | 1,3 ± 0,3 |
| 7 | 0,6 ± 0,3 | 1700 ± 200 | 260 ± 250 | 1,6 ± 1,0 |
| 1 – 7 | 0,7 ± 0,2 | 1900 ± 100 | 100 ± 100 | 1,1 ± 0,2 |
Tabell 5: Resultat från fyra parameterlogistiska anfall som tillämpas på typiska dosresponsdata. De dosresponsdata som används för analys presenteras i figur 2. Hela koncentrationsområdet tillämpades på analys för de enskilda brunnarna en till sju(figur 2B)och för de genomsnittliga uppgifter som erhållits från brunnar en till sju(figur 2D). Ingen av parametrarna för logistikfunktionen fastställdes under minsta kvadratoptimering. Anpassa resultaten avrundades till årtiondet av felet, utom om värdet var mindre än felet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för etikettfria impedansmätningar för att bestämma dosresponsförhållandet hos agonist-inducerad GPCR-aktivering i frånvaro eller närvaro av specifika antagonister för samma receptor. Beviset på begreppet för denna metod presenterades i en nyligen publiceradpublikation 12. Vår kännedom är det den första studien som beskriver inrättandet av en fullständig dosresponskurva av agonistisk-medierad GPCR-aktivering med hjälp av ett enda celllager in vitro. Tillvägagångssättet kräver oundvikligen användning av etikettfria cellövervakningsmetoder och kommer inte att vara tillämplig på endpoint-analyser.
Protokollet har visats på exemplet med U-373 MG celler, som endogenöst uttrycka den mänskliga histamin 1 receptor (hHR1) som stimuleras med en rad ökande koncentrationer av sin endogena agonist histamin medan impedans av cellerna kontinuerligt registreras. För att visa tillämpligheten av protokollet till antagoniststudier upprepades experimenten i närvaro av en konstant koncentration av difenhydramin, en konkurrenskraftig antagonist till hH1R. Impedansinspelningar har också använts framgångsrikt för att studera andra H1R-agonister (t.ex. UR-KUM53011, individuell och stegvis dosering) och antagonister (t.ex. Mepyramin)12 utöver de exempel som visas här. Dessutom har protokollet tillämpats på andra cellinjer och receptorer också, t.ex. Medan U373-MG- och BAEC-celler uttrycker respektive receptorer H1R och ß2AR på endogena nivåer är CHO-D2R ett exempel för en rekombinant cellmodell. Sammantaget är serieprotokollet i allmänhet tillämpligt på celltyper med endogena eller utomkvedsföremål GPCR-uttryck, GPCR smed olika kopplingstyper Gq (t.ex. H1R), Gs (t.ex. ß2AR), Gi (t.ex. D2R) samt olika ligandtyper (agonist/antagonist). I alla de cell/receptortyper som nämns ovan ökar impedansen med ökande agonistisk koncentration. Vissa celler svarar dock på GPCR-aktivering genom en impedansminskning. Vi testade protokollet för ett sådant fall (HaCaT/histamin) och fann också en koncentrationsberoende stegvis minskning, stödja begreppet en allmänt tillämplig metod som också är kompatibel med omvänd impedans förändringar. Det har föreslagits att den detaljerade tiden för impedansdata visar vilken typ av G-proteinkoppling av en viss receptor. Även om konceptet är attraktivt stöder poolen av våra data inte en allmänt tillämplig regel som korrelerar impedanstidsprofilen till G-proteinkoppling av en viss GPCR6.
Det seriella tilläggsprotokollet kan anpassas till olika typer av elektrodlayouter och flerbrunnsformat. Det är tillämpligt på perfusionssystem på chip, vilket är en betydande fördel jämfört med många etikettbaserade metoder som ofta kräver ett celllager för att en koncentration ska testas. Följaktligen kan det seriella doseringssystemet bana väg för dosresponsstudier i mer komplexa biologiska modeller som organ-on-a-chip eller till och med metoder för människa-på-ett-chip. Impedansmätningar upptäcker ett integrerat, distala svar från cellerna till receptoraktivering som i slutändan inducerar cellmorfologiförändringar. Denna ganska allmänna och ospecifika men också opartiska avläsning är grunden för dess breda tillämplighet som inte är begränsad till GPCRs men kan också fungera för andra klasser av cellytanreceptorer, cytoplasmareceptorer eller till och med intracellulära proteiner som mål.
Det är avgörande för det stegvisa agonistiska tilläggsprotokollet att arbeta med konfluenta cellskikt på elektroderna, eftersom glesa kulturer kommer att störa känslighet, reproducerbarhet och datatolkning. En ytterligare förutsättning för framgångsrik övervakning av receptoraktivering även i konfluenta cellmonolayers är en förändring i cellform längs signaltransduktionskaskaden. Om de celler som studeras inte ändrar sin morfologi längs experimentet, impedans-baserade avläsningar är blinda och kommer inte att rapportera om någon förändring i receptoraktivitet. För att korrekt utforma det seriella tilläggsprotokollet rekommenderas inledande förtestning i konventionellt ett-väl-en-koncentrationsläge för att bestämma koncentrationsområdet för agonist ungefär och tidsintervallet mellan efterföljande agonistiska tillägg. Tidsintervall mellan sekventiella doser av agonist bör skräddarsys så att systemet antar en ny jämvikt före nästa, högre dos tillsätts. Följaktligen kan metoden vara mindre användbar för receptorer som utlöser en mycket snabb och endast övergående reaktion av cellerna eller en mycket långsam reaktion som kan ta timmar att slutföra. Den senare situationen skulle öka den totala tiden för experimentet och uppmana till parallella tilläggsprotokoll för att korta labbtiden. I exemplen ovan var den totala körningen av experimentet 2,5 – 3,5 timmar, beroende på antalet koncentrationer (8 eller 10) och en potentiell pre-inkubation med antagonist. Samma experiment i konventionell parallella agonist tillägg läge skulle bara ta ~ 1 h för samma cell-receptor modell men med mycket mindre dataflöde. En klar fördel med den seriella metoden är att antalet koncentrationer som behöver testas för en fullständig dosresponsförhållande inte begränsas av antalet tillgängliga brunnar. Om högre agonistiska koncentrationer behövs, är experimentet enkelt förlängas och slutföras utan ytterligare cellkultur arbete. Agonist tillägg i sig bör utföras noggrant, eftersom vissa celler är känsliga för skjuvning stress och svara med betydande impedans förändringar helt enkelt på grund av mekanisk stimulering som införts genom vätskehantering. Cellerna kan till och med komma från elektroden. Detta problem är dock inte unikt för impedansbaserad cellövervakning utan gäller även andra tekniker. För känsliga celler rekommenderas additionsläge 1 på grund av minskad mekanisk belastning på cellerna. Detta läge fungerar dock med lägre vätskevolymer under tillägg vilket ökar risken för ofullständig blandning eftersom intensiv agitation inte rekommenderas för att undvika ospecifika cellsvar.
Additionsläge 1 går tillsammans med en stegvis ökning av den totala volymen i brunnen medan läge 2 håller den totala volymen konstant eftersom lika mycket lösning är sekventiellt bort. Dessa är bara de två extrema strategier och kan anpassas för speciella celltyper, multi-well format eller elektrod layouter på något mellanliggande sätt. När det gäller U373-MG/H1R-modellen har små skillnader i EG50- och EMax-värden observerats för det seriella additionsläget jämfört med det konventionella parallella additionsläget (seriellt. N = 30: EG50: (0,8 ± 0,3) μM, EMax: (1,9 ± 0,2) kΩ; parallell, N = 15: EC50: (0,5 ± 0,2) μM, EMax: (1,3 ± 0,3) kΩ), medan andra cell-/receptormodeller inte visade några skillnader. Förändringar i EG50 och EMax värden kan härledas från receptordesensibilisering som är mer sannolikt att inträffa när receptorerna utsätts för agonist under längre tider. Desensibiliseringspåverkan beror starkt på receptorn och liganden som studeras. Det återstår att klargöra om en detaljerad analys av serielloch parallell agonist tillägg kan ge ett nytt sätt att studera receptordesensibilisering.
Vi rekommenderar att du utför ett kontrollexperiment med konventionellt parallelllägesagonisttillägg för att testa för potentiella förändringar i dosresponskurvor. Ytterligare kontroller bör omfatta ett prov som endast behandlats med medel/lösningsmedel i lämpliga doser för att riva upp eventuella effekter på grund av lösningsmedelsbelastning eller mekanisk belastning vid medeltillägg. Detta blir bestämt viktigt, om lagerlösningen av liganden bereds i andra lösningsmedel än medel (e.g., DMSO, ethanol). Vid undersökning av effekten av olika ligands en standard agonist bör ingå som referens.
Framtida riktningar bör omfatta automatiska vätskehanteringsenheter, vilket kan möjliggöra helt automatiserad dosering eller titrering. Tillämpa serielladditionsläge i perfusionssystem har stor potential för lab-on-a-chip och organ-på a-chip metoder, samt för experiment som utförs under flytande skjuvning stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Barbara Goricnick och Nadja Hinterreiter för deras hjälp med cellodling och beredning av experimentella lösningar. Författarna erkänner tacksamt ekonomiskt stöd av Research Training Group 1910 "Medicinal chemistry of selective GPCR ligands" som finansieras av Den tyska forskningsstiftelsen (DFG) under bidragnummer 222125149. JAS är särskilt tacksam för ett stipendium som beviljats av det bayerska jämställdhetsprogrammet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | |
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 - 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 - 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) | \ |
References
- Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
- Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs. Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).
- Kaitin, K. I. Deconstructing the drug development process: The new face of innovation. Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).
- Kenakin, T. P. Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).
- Scott, C. W., Peters, M. F. Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening. Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophysical Journal. 91, 16 (2006).
- Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).
- Lieb, S., et al. Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor. Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).
- Stolwijk, J. A., et al. Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol. Integrative Biology. 11, 10 (2019).
