Drosophila Condicionamento de namoro: um método para testar o aprendizado e a memória em moscas

Overview

Este vídeo descreve um ensaio de condicionamento clássico que testa o aprendizado e a memória em Drosophila, chamado condicionamento de namoro. O ensaio baseia-se na redução do namoro masculino após sofrer uma rejeição por uma fêmea pré-noiva não receptiva. O protocolo de exemplo mostra uma configuração para o procedimento que pode ser usada para avaliar a memória de curto e longo prazo.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Koemans et al., Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory, J. Vis. Exp. (2017).

NOTA: No protocolo descrito abaixo, uma réplica da coleta, treinamento e testes é descrita. Para testar a reprodutibilidade dos resultados, essas etapas devem ser repetidas em paralelo, em vários dias, e com grupos separados de moscas(Tabela 1). O protocolo é baseado em um ciclo de vida de 10 dias de ovo para adulto, o que é normal ao criar moscas em condições constantes de 25 °C, 70% de umidade e um ciclo claro/escuro de 12 horas. Todos os aspectos deste protocolo assumem que as condições são mantidas constantes durante todo o ensaio. Os horários são indicados como horas antes das luzes acenderem (BLO) ou depois que as luzes se acenderem (ALO) na incubadora, pois isso pode ser convenientemente definido dependendo da hora preferida do pesquisador. Use gás CO_{2 apenas} para a coleção inicial de moscas machos ingênuas e para a coleta de fêmeas pré-emmaadas. Este protocolo de condicionamento de namoro é composto pelas seguintes etapas:

1. Estabelecimento de culturas de coleta feminina pré-emmaadas
2. Estabelecimento de culturas para a coleta de sujeitos de teste masculinos
3. Elaboração de blocos habitacionais
4. Estabelecimento de frascos de acasalamento para a produção de fêmeas pré-matizadas padronizadas
5. Coleção de cobaias masculinas
6. formação
7. teste
8. Análise e estatística de dados de vídeo

1. Estabelecimento de Culturas de Coleção Feminina Pré-Emmassada

1. Prepare comida elétrica. Ferva 0,8% (p/v) ágar, 8% (w/v) levedura, 2% (p/v) extrato de levedura, 2% (w/v) peptone, 3% (w/v) sacarose, 6% (w/v) glicose, 0,05% (w/v) MgSO₄e 0,05% (w/v) CaCl₂ na água por 15 min. Deixe a solução esfriar a 70 °C antes de adicionar 0,05% (w/v) metilparabene(ATENÇÃO: tóxico) e 0,5% (v/v) ácido propônico(ATENÇÃO: tóxico). Misture bem mexendo ao esfriar ainda mais até 50 °C para obter uma solução homogênea.
2. Antes que o alimento se solidifique à temperatura ambiente, adicione ~50 mL de alimentos movidos a cada frasco plástico de 175 mL. Deixe a comida esfriar ainda mais. Feche o frasco com um plugue.
   NOTA: Powerfood é uma mistura de alimentos especializados formulada especificamente para a produção de um grande número de moscas, presumivelmente induzindo a colocação de ovos. Powerfood não é usado para produzir moscas machos que serão usados para análise de comportamento (passo 2) porque a dieta atípica e o potencial de aglomeração podem influenciar o desenvolvimento.
3. No dia -11 (Tabela 1), comece 5-20 culturas de tipo selvagem com aproximadamente 60-100 moscas (uma mistura de machos e fêmeas) em frascos de alimentos movidos a energia; estes serão usados na etapa 4 para produzir fêmeas pré-desmatadas padronizadas. Adicione um papel filtro a cada frasco para aumentar a área sobre a qual as larvas podem filhote; isso aumentará o número de moscas que podem se escoar.
4. Repita periodicamente as etapas 1.1-1.3 ao longo do experimento para obter moscas recém-eclosing suficientes como entrada para o "estabelecimento de frascos de acasalamento para a produção de fêmeas pré-matizadas padronizadas" (etapa 4).

2. Estabelecimento de Culturas para o Acervo de Sujeitos de Teste Masculino

1. Prepare alimentos normais, feitos com 0,5% (w/v) ágar, 2,75% (w/v) levedura, 5,2% (p/v) farinha de milho, 11% (w/v) açúcar, 0,05% (w/v) metilparabene e 0,5% (v/v) ácido propímico na água, conforme descrito nas etapas 1,1 e 1,2. Feche os frascos de plástico de 175 mL com um plugue de frasco de mosca.
2. No dia -10 (Tabela 1),coloque cerca de 10 a 20 machos com aproximadamente 30-75 fêmeas virgens(Tabela materiais/equipamentos)em cada frasco de 175 mL contendo alimentos normais. Adicione um papel filtro para aumentar a área da superfície para pupação e maximizar a produtividade.
3. Estabeleça de três a seis frascos de 175 mL por genótipo para obter o número necessário de homens sujeitos de teste.
   NOTA: Mais frascos podem ser necessários, dependendo da produtividade do genótipo desejado.

3. Preparação de Blocos Habitacionais (Figura 2A)

1. Derreta aproximadamente 50 mL de powerfood por bloco de habitação em um micro-ondas, ou prepare-o fresco.
2. Adicione 500 μL de powerfood a cada poço de um bloco de fundo plano de 96 poços usando uma pipeta multimissora.
3. Deixe que os alimentos se solidifiquem à temperatura ambiente.
4. Cubra os blocos com filme adesivo PCR e use uma agulha para fazer pelo menos 4 furos por poço para fornecer ar fresco às moscas.
5. Para poder abrir cada poço, use uma lâmina de barbear para cortar o filme adesivo longitudinalmente entre cada linha. Deixe o filme intacto em uma extremidade do quarteirão.
6. Os blocos podem ser armazenados a 4 °C por até 2 dias.
   NOTA: Deixe que os blocos se equilibrem até a temperatura ambiente antes de serem utilizados.

4. Estabelecimento de Frascos de Acasalamento para a Produção de Fêmeas Pré-Matizadas Padronizadas

1. No dia -1, remova e descarte todas as moscas selvagens adultas das culturas de coleta feminina pré-emarmadas a 2-5 h BLO.
2. Recolher moscas usando o aspirador (Figura 2B) desses frascos em intervalos de 2 a 3 h(por exemplo, a 30 min, 2,5 h e 5 h ALO) e colocá-las em um novo frasco de alimentação complementada com uma pequena quantidade de pasta de levedura e papel filtro.
3. Para evitar aglomeração e promover uma atmosfera de acasalamento ideal, não transfira mais de 150-200 moscas para cada novo frasco. Garanta o acasalamento de todas as fêmeas fornecendo pelo menos 25% de machos. Certifique-se de que fêmeas suficientes estão presentes nos frascos de acasalamento para acomodar o tamanho do experimento.
   NOTA: Como este é um passo crucial no protocolo, certifique-se de que apenas moscas recém-eclodidas e nenhuma mosca velha, larvas ou pupas sejam transferidas para o novo frasco de acasalamento.
4. Incubar esses "frascos de acasalamento" por quatro dias para dar tempo suficiente para todas as fêmeas terem acasalado.

5. Coleção de Sujeitos de Teste Masculinos

1. No dia 1(Tabela 1) às 2-3 h BLO, use CO₂ para remover todas as moscas adultas dos frascos de coleta masculina (passo 2), mas deixe mais moscas se fecharem nas próximas horas.
2. Ao longo das próximas 5-6 h, remova moscas recém-eclosadas a cada 20-30 min usando CO₂ e coloque cada macho em um poço individual do bloco de habitação (passo 3) usando o aspirador(Figura 2B).
3. Selar o poço com o filme PCR adesivo.
   NOTA: Este é um passo crucial no protocolo. Os machos devem ser coletados com frequência. Os machos coletados devem ser isolados no bloco habitacional próximo ao tempo de eclosão, quando demonstram pigmentação pálida e a presença do mecônio no abdômen translúcido.
   NOTA: O uso suave do aspirador permite a transferência de moscas; no entanto, o uso inadequado enfatizará as moscas, causando variância no ensaio (ver a Discussão).
4. Procure coletar até 48 machos por genótipo. Isso fornece um pequeno excesso ao número máximo de machos necessários para a análise de condições ingênuas e treinadas, permitindo alguma perda durante as etapas posteriores de transferência.

6. Treinamento

1. Remova as moscas do frasco de acasalamento (passo 4.2) usando CO₂ e separe as fêmeas pré-matadas dos machos.
2. Usando o aspirador, adicione uma única fêmea anestesiada e pré-omada a cada poço em uma fileira de um novo bloco habitacional.
3. Usando o aspirador e sem anestesia, transfira um macho ingênuo individual do bloco habitacional montado na etapa 5.2 para o poço contendo uma fêmea pré-ferida. Depois que o macho é colocado no poço, re-selar imediatamente com o filme adesivo; não permitir que o macho escape.
   NOTA: Transfira moscas machos do aspirador para o bloco habitacional aproveitando seu comportamento natural de "geotaxis negativos".
4. Repetir passos 6.2-6.3 até que pares masculinos e femininos suficientes sejam estabelecidos. Idealmente, estabelecer 24 pares, duas fileiras completas de um bloco habitacional, por genótipo. Deixe os machos ingênuos restantes no bloco habitacional original montado na etapa 5.2.
5. Deixe os pares masculino-feminino imperturbáveis durante o período de treinamento (Tabela 2, Figura 1B).
   NOTA: Durante este tempo, o macho irá cortejar e será rejeitado pela fêmea pré-demada. Para aprendizagem e STM, o período de treinamento é de 1h e para LTM, o período de treinamento é de 7 a 9 h.
6. Finalizar o treinamento (Tabela 2, Figura 1B) usando um aspirador para separar suavemente o macho da fêmea pré-demada; não use anestesia. Coloque o macho separado em um novo bloco habitacional.
7. Use o aspirador para transferir todos os machos ingênuos suavemente e sem anestesia do bloco habitacional montado na etapa 5.2 para um novo bloco habitacional.
   NOTA: Esta etapa é opcional para STM e aprendizado, mas é muito importante para o LTM porque as moscas estão alojadas por mais 24 horas para testar o LTM.
8. Para STM e LTM, deixe os machos descansarem por 1h e ~24 h, respectivamente(Tabela 2, Figura 1B) antes do teste (etapa 7).
9. Para aprender, teste imediatamente os machos treinados e ingênuos (passo 7).

7. Teste

1. Recolher moscas de frascos de acasalamento (passo 4.2) usando CO₂ e separar as fêmeas pré-matadas dos machos.
2. Deixe as fêmeas se recuperarem da anestesia por pelo menos 1h em um frasco contendo alimentos normais.
3. Monte os gravadores de vídeo com antecedência(Figura 2C),a fim de ter todos os equipamentos prontos antes do início dos testes.
4. Inicie o teste de acordo com os diferentes cronogramas de aprendizagem, STM e LTM (Tabela 2, Figura 1B). Realizar testes imediatamente após o treinamento para aprendizagem, 1h após o treinamento para STM, e 24 horas após o treinamento para LTM.
5. Utilizando o aspirador, transfira suavemente um homem individual do bloco de habitação de repouso ou do bloco de alojamento de treinamento se o aprendizado estiver sendo testado (etapa 6.7, treinado; passo 6.8, ingênuo) para metade de uma arena de namoro com o divisor fechado(Figura 2D; ver Arquivo S1 para um plano de construção).
   NOTA: O uso do comportamento natural de "geotaxis negativos" deve ser suficiente para transferir as moscas machos do aspirador para a arena de namoro.
6. Mova rapidamente, mas suavemente, o buraco de entrada para a próxima arena e repita o passo 7.5 até que todas as 18 arenas contenham um macho.
7. Utilizando o aspirador e sem CO_2,adicione uma fêmea pré-demada (coletada na etapa 7.2) à outra metade de todas as 18 arenas.
8. Coloque cuidadosamente a câmara de namoro sob a câmera, com a abertura dos poços voltados para baixo(Figura 2C).
9. Remova o divisor das arenas para permitir interação direta entre os machos e as fêmeas pré-matadas.
10. Imediatamente comece a registrar o comportamento por pelo menos 10 minutos.
    NOTA: Ao usar uma configuração de duas câmeras, a gravação paralela de duas placas de namoro pode ser feita em prazos sobrepostos para maximizar a eficiência.
11. Esvazie as arenas de namoro usando um aspirador de pó portátil e permita que a câmara de namoro ventile antes de reutilizar.
12. Repetir a etapa 7.4-7.11 até que os testes de todos os genótipos e condições (ou seja, ingênuos e treinados) tenham sido concluídos.

8. Análise e Estatística de Dados de Vídeo

1. Calcular o índice de namoro (IC), definido como o percentual de tempo que os tribunais masculinos durante os primeiros 10 minutos do período de teste, para cada mosca masculina individual.
   NOTA: Isso pode ser feito manualmente observando o comportamento estereotipado de namoro(Figura 1A) ou usando software de computador para quantificação automatizada do comportamento de namoro.
   NOTA: Recomenda-se analisar 40-60 machos por condição ao longo de três dias, a fim de alcançar poder estatístico suficiente e julgar a consistência dos dados de IC.
2. Calcule o índice de aprendizagem (LI), definido como a redução percentual na IC média de homens treinados em comparação com os machos ingênuos (LI = (IC_ingênuo –_{CI treinado}) / IC_ingênuo). Avalie o LI para cada dia de teste e compare-o com o LI cumulativo calculado a partir de todos os dias de teste combinados.
3. Faça um arquivo de dados de guia de duas colunas separado com "Genótipo" e "CI" como cabeçalhos.
   NOTA: Esses títulos são sensíveis ao caso. O nome do genótipo para cada IC deve consistir em uma descrição do genótipo seguido por um sublinhado e a condição de treinamento (por exemplo, genotype_N e genotype_LTM, etc., onde N = ingênua e LTM = memória de longo prazo; ver Arquivo Suplementar S2 como exemplo). Essa anotação é essencial, pois a função analearn identificará moscas treinadas e ingênuas com base nos personagens presentes após o primeiro sublinhado na coluna "Genótipo".
4. Use o script R analearn (Arquivo Suplementar S3) para realizar um teste de randomização para julgar a significância estatística das diferenças entre os valores LI de diferentes genótipos.
   1. Fonte do script (Arquivo Suplementar S3) em R, que define uma função chamada "analearn".
      NOTA: A definição da função é: analearn <- função(nboot = 10.000, nagensível = 'N', refmutação = NA, datname = NA, cabeçalho = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
   2. Inicie a função inserindo "analearn()" na linha de comando R e selecionando o arquivo de dados a ser analisado (produzido na etapa 8.3) através da janela pop-up.
   3. Escolha a mutação de referência, que é o genótipo de controle, digitando o número correspondente e pressionando enter.
      NOTA: Depois de selecionar o genótipo de referência, o script leva vários segundos para executar 10.000 réplicas de bootstrap.
   4. Observe a tabela de saída (Tabela 3), que contém o genótipo, condição de aprendizagem (ou seja,aprendizagem, STM, ou LTM), ic ingênua média, malvada CI treinada, LI, a diferença entre o LI do controle em relação à condição experimental (LI dif), o limite inferior (LL) e o limite superior (UL) do intervalo de confiança de 95% do LI dif, e o valor pindicando a probabilidade de que não haja diferença significativa.
      NOTA: o analearn armazenará um arquivo de texto de saída no diretório onde o arquivo de dados está localizado. No entanto, a tabela de saída também aparece no console R-Studio. O nome padrão é construído com base no nome do arquivo de dados fornecido.
   5. Existem vários argumentos na função analearn que podem ser usados para alterar as configurações padrão da função para ajustar os parâmetros do bootstrapping.
      NOTA: "nboot" define o número de réplicas de bootstrap e é definido como 10.000 por padrão. Este valor pode ser alterado em qualquer número inteiro maior que zero. A Tabela 5 alista vários argumentos que podem ser usados para alterar as configurações padrão da função. No entanto, não é recomendável usar dados que são produzidos com um baixo número de réplicas de bootstrap.

Representative Results

Figura 1: Determinação do Índice de Namoro e Visão Geral Experimental. (A) Imagens mostrando um comportamento de namoro masculino estereotipado em relação a uma mosca fêmea. Diferentes estágios de comportamento de namoro são mostrados: orientação (I), seguinte (II), vibração de asa (extensão) e toques (III), lambida (IV) e tentativa de copulação (V). (B) Visão geral esquemática dos tempos de treinamento e teste em relação ao ciclo de luz da incubadora, marcado em horas. Os tempos de treinamento são indicados com barras, períodos de descanso para STM e LTM são indicados com uma linha tracejada, e o ponto de partida do teste é indicado como uma seta. Observe que o tempo de teste para LTM é o dia após o treinamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Equipamento utilizado para o Ensaio de Condicionamento de Namoro Drosophila. (A) O bloco habitacional é um bloco plano e inferior com 500 μL de powerfood por poço. É selado com uma filme adesivo qPCR com pelo menos 4 orifícios por poço que foram criados usando uma agulha de seringa com um diâmetro de 0,8 mm. As linhas individuais são cortadas longitudinalmente em tiras usando uma lâmina de barbear para permitir a abertura e o fechamento. (B) O aspirador é necessário para a transferência suave de moscas machos e fêmeas sem o uso de anestesia. O inset mostra a ponta do aspirador, fechado com um pedaço de algodão para manter as moscas dentro da ponta. (C) Configuração de um sistema de duas câmeras para a gravação simultânea de duas câmaras de namoro. (D) Uma câmara de namoro com 18 arenas. Buracos de entrada deslizantes são usados para colocar as moscas nas arenas. Os divisores brancos podem ser abertos simultaneamente para iniciar a interação entre os machos e as fêmeas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Cronograma de exemplo para testar o LTM sobre três réplicas em dias individuais.

	Geral	coletar	Trem	teste
dia -11	Iniciar culturas de coleta feminina pré-emmassadas (passo 1.3)
dia -10	Iniciar culturas para a coleta de sujeitos de teste masculinos (etapa 2.2)
dia 1		representante 1
dia 2		representante 2
dia 3		representante 3
dia 4		representante 4	representante 1
dia 5			representante 2	representante 1
dia 6			representante 3	representante 2
dia 7			representante 4	representante 3
dia 8				representante 4
dia 9	Análise e estatística de dados de vídeo (etapa 8)
rep = repetição

Tabela 2: Duração do treinamento, tempos de treinamento e tempos de teste para aprendizado, STM e LTM

	aprendizagem	Stm	LTM
Tempo de treinamento	1h.	1h.	Às 8h.
Tempo de descanso	0h.	1h.	~ 24 horas.
começar a treinar	0 h. ALO	0 h. ALO	4 h. BLO
parar de treinar	1 h. ALO	1 h. ALO	4 h. ALO
iniciar o teste	1 h. ALO	2 h. ALO	0 h. ALO (dia seguinte)
ALO = após as luzes acenderem, BLO = antes que as luzes se acitem, STM = memória de curto prazo, LTM = memória de longo prazo

Tabela 3: Dados Estatísticos Produzidos a partir do Script Analearn.
Dados estatísticos produzidos a partir do roteiro analearn. O arquivo de saída do script R-script que contém o genótipo, condição de aprendizagem(ou seja,aprendizagem, STM ou LTM), significa IC ingênuo, CI médio treinado, LI, diferença entre LI do controle em relação à condição experimental (LI dif), o limite inferior (LL) e limite superior (UL) do intervalo de confiança de 95% do LI dif, e o valor pindicando a probabilidade de que não haja diferença significativa.

genótipo	aprendizagem	Ci	Ci	LI	LI	Limite inferior	Limite superior	p-valor
	condição	ingénuo	Treinados		diferença	(intervalo de conficência de 95%)	(intervalo de conficência de 95%)
Controle	Stm	0.467	0.116	0.752	NA	NA	NA	NA
Dhap-at-RNAi	Stm	0.699	0.257	0.633	0.119	-0.03	0.265	0.116
Controle	LTM	0.59	0.384	0.348	NA	NA	NA	NA
Dhap-at-RNAi	LTM	0.697	0.65	0.068	0.28	0.103	0.446	0.003

Arquivo Suplementar S1: Plano de construção de uma câmara de namoro. O arquivo pode ser aberto com qualquer aplicativo que permita extensões .stp (CAD-files). Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar S2: Exemplo de um arquivo de entrada para o script Analearn. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar S3: O Script Analearn.R. O arquivo pode ser aberto com r-studio. Clique aqui para baixar este arquivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
P{KK101437}VIE-260B	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B	-	-	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)	-	-	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	-	-	Any sharp will do
Needle	-	-	0.8 mm diameter
Aspirator	-	-	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	-	-	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	-	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name	Company	Catalog Number	Comments
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	-
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-
Yeast paste	-		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	-
Corn flour	de Molen	-
Sugar	de Molen	-
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-