ייבוש כימי: הכנת דגימה ביולוגית לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)

Overview

סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) היא כלי רב עוצמה לתמונה – בעיקר – תכונות פני השטח של מדגם ביולוגי. הכנת מדגם נכונה, לעומת זאת, היא קריטית להשגת תמונות איכותיות. וידאו זה מתמקד התייבשות וצעדי ייבוש של הכנת Drosophila מבוגר שלם עבור SEM.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Koon et al., הכנת אורגניזמים פרוקריוטיים ואוקריוטיים באמצעות ייבוש כימי לניתוח מורפולוגי בסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM), J. Vis. Exp. (2019).

1. הכנה וקיבעון

1. הכינו את דרוזופילה מלנוגאסטר (זבוב פירות).
   1. יש למרדים זבובים בוגרים באמצעות 100% פחמן דו-חמצני. מניחים מבוגרים מורדם (כ 10 עד 30 זבובים) בבקבוקון בורג פלסטיק קטן כובע או 1.5 צינור צנטריפוגה מ"ל.
   2. לטבול זבובים מורדמים ב 1 מ"ל של קיבוע (1.25% glutaraldehyde, 0.1 M פוספט מאגר pH 7.2) עבור 2 שעות (או לילה) ב 4 מעלות צלזיוס. אם הזבובים צפים אל פני השטח של הקיבוע, להוסיף כמה טיפות של 2.5% פוליאתילן גליקול tert-octylphenyl אתר כדי להחליש את מתח פני השטח של התיקון המאפשר טבילה מוחלטת של הרקמה. הסר את התיקון באמצעות צינור זכוכית.

2. כביסה והתייבשות

1. לשטוף ולייבש Drosophila מלנוגאסטר (זבוב פירות).
   1. לשטוף את המדגם הקבוע שלוש פעמים עם 1 מ"ל של 0.1 M פוספט חיץ pH 7.2 בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. הסר כל לשטוף עם פיפטה זכוכית, נזהר לא להסיר את הזבובים.
   2. לייבש את המדגם באמצעות סדרת אתנול מדורגת, במשך 10 דקות בנפח של 1 מ"ל בצינור microfuge. ריכוזי האתנול הם: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. הסר את האתנול עם פיפטה זכוכית, נזהר לא להסיר את הזבובים.
   3. שמור את המדגם בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל עם מספיק 100% אתנול כדי לכסות את המדגם לפני הייבוש.

3. ייבוש

1. בצע ייבוש כימי באמצעות הקסמתילדיסילאזן (HMDS).
   1. החלף את הפתרון 100% אתנול עם פתרון 1:2 של HMDS ו 100% אתנול במשך 20 דקות. החלף את הפתרון 1:2 עם פתרון 2:1 של HMDS ו 100% אתנול במשך 20 דקות. החלף את הפתרון 2:1 עם 100% HMDS במשך 20 דקות.
      הערה: HMDS הוא דליק ורעלן חריף (מסלול עורי). HMDS צריך להיות מטופל מכסה המנוע אדים כימיים באמצעות ציוד מגן אישי מתאים כולל כפפות, חלוק מעבדה, והגנה על העיניים.
   2. מעבירים את הדגימה ב- HMDS, אם בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, לצלחת שקילה חד פעמית מאלומיניום. פעם אחת בצלחת שקילה אלומיניום, להחליף את HMDS 100% עם רק מספיק טרי 100% HMDS כדי לכסות את המדגם.
   3. מעבירים את הדגימה לתייבש פלסטיק או זכוכית ללא ואקום עם יבוש טרי (בעומק 5-6 ס"מ) ומכניסים למכסה המנוע הכימי. לחלופין, מניחים את המדגם ישירות במכסה המנוע של אדים כימיים לייבוש עם מכסה רופף, כגון קופסה, כדי למנוע מפסולת ליפול על הדגימה. אפשר לדגימה להתייבש במשך 12 עד 24 שעות.

4. הרכבה

1. הר דרוזופילה מלנוגאסטר (זבוב פירות).
   1. סמן את החלק התחתון של בדל הרכבה מאלומיניום כדי לציין מה ממוקם למעלה.
      מניחים את הזבובים המיובשים בתנוחה הרצויה על לשונית דבק או דבק פחמן מאובטח לחלק העליון של בדל תחת מיקרוסקופ מנתח עם פינצטה מדויקת.
   2. החל דבק מוליך כסף, כלומר,צבע כסף, סביב הקצוות החיצוניים של הספחים. חבר את צבע הכסף לזבובים באמצעות קיסם כדי להבטיח מוליכות. אל תאפשר לצבע לגעת באזור ההדמיה הרצוי.
   3. מניחים את הספחים בתיבת מחזיק בדל ומניחים את תיבת מחזיק הספח הפתוחה במייבש. אפשר לצבע הכסוף להתייבש לפחות 3 שעות או לילה לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/	The company doesn't appear to sell this model any longer