Chemische Trocknung: Biologische Probenvorbereitung für Diescanelektronenmikroskopie (SEM)

Overview

Die Rasterelektronenmikroskopie (SEM) ist ein leistungsstarkes Werkzeug, um die Oberflächenmerkmale einer biologischen Probe in erster Linie abzubilden. Die richtige Probenvorbereitung ist jedoch entscheidend für die Erstellung von Qualitativbildern. Dieses Video konzentriert sich auf die Austrocknung und Trocknungsschritte der Vorbereitung intakter erwachsener Drosophila für SEM.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Koon et al., Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM), J. Vis. Exp. (2019).

1. Vorbereitung und Fixierung

1. Bereiten Sie Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) vor.
   1. Anästhesisieren Sie erwachsene Fliegen mit 100% Kohlendioxid. Anästhesisierte Erwachsene (ca. 10 bis 30 Fliegen) in eine kleine Kunststoff-Schraubverschluss-Durchstechflasche oder 1,5 ml Zentrifugenrohr legen.
   2. Anästhesisierte Fliegen in 1 ml fixative (1,25% Glutaraldehyd, 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,2) für 2 h (oder über Nacht) bei 4 °C eintauchen. Wenn die Fliegen an die Oberfläche des Fixiermittels schweben, fügen Sie ein paar Tropfen von 2,5% Polyethylenglykoltert-Octylphenylether hinzu, um die Oberflächenspannung des Fixativs zu schwächen, was ein vollständiges Untertauchen des Gewebes ermöglicht. Entfernen Sie das Fixativ mit einer Glaspipette.

2. Waschen und Austrocknung

1. Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) waschen und dehydrieren.
   1. Waschen Sie die feste Probe dreimal mit 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,2 bei Raumtemperatur für 10 min in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Entfernen Sie jede Wäsche mit einer Glaspipette, wobei Sie darauf achten, die Fliegen nicht zu entfernen.
   2. Dehydrieren Sie die Probe mit einer abgestuften Ethanolserie, für 10 min in einem Volumen von 1 ml in einem Mikrofugenrohr. Die Ethanolkonzentrationen sind: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Entfernen Sie das Ethanol mit einer Glaspipette, wobei Sie darauf achten, die Fliegen nicht zu entfernen.
   3. Bewahren Sie die Probe im 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit gerade genug 100 % Ethanol auf, um die Probe vor dem Trocknen zu bedecken.

3. Trocknen

1. Chemische Trocknung mit Hexamethyldisilazan (HMDS).
   1. Ersetzen Sie die 100%ige Ethanollösung durch eine 1:2-Lösung aus HMDS und 100% Ethanol für 20 min. Ersetzen Sie die 1:2-Lösung durch eine 2:1-Lösung von HMDS und 100% Ethanol für 20 min. Ersetzen Sie die 2:1-Lösung durch 100% HMDS für 20 min. Einmal wiederholen.
      Hinweis: HMDS ist entzündlich und ein akutes Toxin (dermaler Weg). HMDS sollte in einer chemischen Dunstabzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhen, Laborlack und Augenschutz behandelt werden.
   2. Die Probe in HMDS, wenn in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, in eine Einweg-Aluminium-Wägeschale geben. Einmal in der Aluminium-Wägeschale, ersetzen Sie die 100% HMDS mit gerade genug frischen 100% HMDS, um die Probe zu decken.
   3. Die Probe mit frischem Trockenmittel (5-6 cm tief) in einen Nichtvakuum-Trockenschrank aus Kunststoff oder Glas geben und in eine chemische Dunstabzugshaube geben. Alternativ können Sie die Probe direkt in eine chemische Rauchhaube geben, um sie mit einem losen Deckel, z. B. einer Schachtel, zu trocknen, um zu verhindern, dass Schmutz auf die Probe fällt. Die Probe 12 bis 24 h trocknen lassen.

4. Montage

1. Mount Drosophila melanogaster (Fruchtfliege).
   1. Beschriften Sie den Boden des Aluminium-Montagestummels, um anzuzeigen, was oben platziert wird.
      Platzieren Sie die getrockneten Fliegen in der gewünschten Position auf der Klebe- oder Carbon-Klebela, die mit einer Präzisions-Pinzette an der Oberseite eines Stubs befestigt ist.
   2. Tragen Sie silbernen leitfähigen Klebstoff, d.h.,Silberfarbe, um die äußeren Ränder der Stubs auf. Verbinden Sie die silberne Farbe mit den Fliegen mit einem Zahnstocher, um die Leitfähigkeit zu gewährleisten. Lassen Sie die Farbe nicht den gewünschten Bildbereich berühren.
   3. Legen Sie die Stubs in einen Stubhalter-Box und legen Sie den offenen Stubhalter-Box in einen Austrocknungskasten. Lassen Sie die silberne Farbe mindestens 3 h oder über Nacht trocknen, um beste Ergebnisse zu erzielen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/	The company doesn't appear to sell this model any longer