Overview
يصف هذا الفيديو كيفية إعداد شرائح اليرقات المستخدمة لتصور الخلايا العصبية التغصنية الحسية (da) وخلايا البشرة المرتبطة بها. يظهر البروتوكول المميز بالتفصيل كيفية إزالة الأنسجة العضلية من جدار الجسم مع الحفاظ على مورفولوجيا الخلايا ، مما يحسن مناعة وتصور الخلايا العصبية الغامضة وخلايا البشرة.
Protocol
هذا البروتوكول هو مقتطف من Tenenbaum و Gavis ، إزالة أنسجة العضلات Drosophila من شرائح اليرقات لتحليل Immunofluorescence من الخلايا العصبية الحسية وخلايا البشرة ، J. Vis. Exp. (2016).
ملاحظة: الإجراء لإزالة العضلات (الشكل 1) هو تعديل الطرق الموصوفة سابقا لإعداد شرائح اليرقات. وترد الخطوات التي تسبق وتتبع إزالة العضلات بإيجاز، ويشار القارئ إلى العمل السابق في برنت، وآخرون، J. Vis. Exp. (2009) وكريم ومور، J. Vis. Exp. (2011) للحصول على أوصاف أكثر تفصيلا.
1. تشريح اليرقات في المالحة الباردة
- إعداد تخفيف العمل من HL3.1 الباردة المالحة أو الباردة كا2 +-الحرة HL3.1 المالحة (الجدول 1). ضع اليرقة في طبق إلاستومر سيليكون مع ما يكفي من المالحة الباردة لتغطية الجزء السفلي من الطبق.
ملاحظة: نوصي بتجربة استخدام Ca2 +- free HL3.1 المالحة مقابل HL3.1 المالحة القياسية أثناء تشريح اليرقات. في غياب الكالسيوم ، يتم تقليل تقلصات عضلات اليرقات بشكل كبير. وبالتالي ، قد يكون من الأسهل التلاعب بشرائح اليرقات عند تشريحها في Ca2 +- free HL3.1 saline. ومع ذلك ، نجد أن تقلص العضلات يخلق مساحة بين العضلات و البشرة وهذا يمكن أن يسهل إدخال ملقط بين هذه الأنسجة مع تقليل خطر تلف البشرة. ونتيجة لذلك، قد يكون المعيار HL3.1 الأفضل للحفاظ على سلامة البشرة والخلايا العصبية دا. نحصل على نتائج جيدة مع المالحة أما ويترك الخيار للمستخدم. - ضع اليرقة مع الجانب البطني لأعلى. يمكن التعرف على السطح البطني لليرقة من خلال الأحزمة الدنتية البطنية والجانب الظهري بواسطة أنابيب القصبة الهوائية اليرقات الأولية التي تمتد من الأمامي إلى الخلفي. تمتد اليرقة في الاتجاه الأمامي الخلفي ودبوس الرأس والذيل إلى طبق تشريح الاستومر السيليكون باستخدام دبابيس الحشرات. استخدام مقص تشريح غرامة لقطع على طول خط الوسط البطني، بدءا من نهاية واحدة والتقدم نحو الآخر.
ملاحظة: هذا التوجه يحافظ على الكتلة الظهرية درس عادة من الخلايا العصبية دا. - بعد قطع اليرقة مفتوحة ، دبوس الزوايا الأربع إلى طبق تشريح كما لو فتح كتاب. استخدام ملقط للاستيلاء على وإزالة الأعضاء الداخلية بما في ذلك الجهاز العصبي المركزي, القناة الهضمية, والرغامى. ضبط دبابيس الحشرات بحيث فيليه مشدود ولكن ليس امتدت إلى أقصى حد.
ملاحظة: ترتكز العضلات على جدار الجسم عند الحدود المجزأة. على الرغم من أن العضلات تغطي معظم جدار الجسم، إلا أنها غائبة في منطقة ضيقة بالقرب من خط الوسط الظهري.
2. إزالة العضلات
- حدد موقع الخط الوسطي الظهري لليرقة ، حيث تغيب الأنسجة العضلية. وضع شوكة ملقط واحد بحيث يمكن إدراجها تحت الأنسجة العضلية في اتجاه ممكن flattest.
- بدءا من خط الوسط الظهري ، بالقرب من الحدود الأمامية للجزء ، قم بتمرير شوكة ملقط بعناية بين العضلات و البشرة ، مع الحرص على تقليل الاتصال بين ملقط البشرة.
- سحب ملقط صعودا لكسر تعلق العضلات إلى جدار الجسم عند نقطة مرساة واحدة. كرر هذه العملية للجزء المتبقي من hemi-(ق) من الفائدة.
ملاحظة: هذا البروتوكول يحسن الحفاظ على الخلفية من كل حقل ديدريت الخلايا العصبية دا. للحفاظ على الجزء الأمامي من الحقل dendrite، فمن الأفضل لإدراج شوكة ملقط في النهاية الخلفية لكل قطعة. - إعادة ضبط دبابيس الحشرات بحيث يتم تمديد فيليه اليرقات إلى أقصى حد في جميع الاتجاهات.
- إصلاح فيليه في حين أنها لا تزال معلقة على طبق تشريح باستخدام الباردة, أعدت حديثا 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 25 دقيقة.
- شطف 5 مرات في برنامج تلفزيوني.
- استخدام ملقط لسحب بعناية بعيدا الأنسجة العضلية من نقاط المرساة المتبقية، مع الحرص على تقليل الاتصال مع البشرة.
- فك وإزالة فيليه من طبق تشريح إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل. تنفيذ جميع الغسيل اللاحقة, حظر, وخطوات تلطيخ immunofluorescence, كما هو موضح سابقا في كريم ومور, J. Vis. Exp. (2011).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1: نظرة عامة على إجراءات إزالة العضلات. يتم تشريح اليرقة وتثبيتها على طبق تشريح الاستومر السيليكوني. لإزالة أنسجة العضلات، يتم إدخال شوكة ملقط واحدة بين العضلات وطبقة الخلية البشرة، بدءا من خط الوسط الظهري بالقرب من حدود الجزء (2.2). يتم سحب ملقط صعودا لكسر الارتباط بين جدار العضلات والجسم (2.3). ويتكرر ذلك بالنسبة لقطاعات الاهتمام ثم يتم إصلاح اليرقة في الفورمالديهايد (2.5). بعد التثبيت ، يتم استخدام ملقط لفصل الأنسجة العضلية المتبقية من جدار الجسم (2.7 - 2.8) يتم تصوير البشرة اليرقات و البشرة باللون البرتقالي ، والخلايا العصبية da من الفئة الرابعة باللون الأخضر ، والعضلات باللون الأحمر. تمثل Insets في (2.2) و (2.7) وجهات نظر مقطعية مقطعية لشريحة هيمي يرقية واحدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| 1x HL3.1 ملحي (درجة الحموضة 7.2) |
| 5 مليون هيبس |
| 70 مليون متر NaCl |
| 5 MM كيلو كلكل |
| 1.5 mM CaCl2 (حذف لCa2 + خالية المالحة) |
| 4 مللي متر ملغCl2 |
| 10 مليون ناهكو3 |
| 5 مليون تريهالوز |
| 115 مليون سكروز |
| تصفية التعقيم وتخزينها عند 4 °C |
| ملاحظة: التركيب يحاكي هيمولم الحشرات |
الجدول 1: تكوين الملح البارد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 |
