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Encyclopedia of Experiments

Preparazione del raccordo larvale: un metodo per visualizzare i neuroni sensoriali intatti e le cellule epidermiche associate

Overview

Questo video descrive come preparare filetti larvali utilizzati per visualizzare i neuroni di arborizzazione dendritica sensoriale (da) e le loro cellule epidermiche associate. Il protocollo in primo piano mostra in dettaglio come rimuovere il tessuto muscolare dalla parete corporea preservando la morfologia delle cellule, che migliora l'immunostaining e la visualizzazione dei neuroni da e delle cellule epidermiche altrimenti oscurati.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Tenenbaum e Gavis, Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells, J. Vis. Exp. (2016).

NOTA: La procedura per la rimozione muscolare(Figura 1) è una modifica dei metodi precedentemente descritti per la preparazione dei filetti larvali. I passaggi che precedono e seguono la rimozione muscolare sono delineati brevemente e il lettore è riferito a precedenti lavori in Brent, et al., J. Vis. Exp. (2009) e Karim e Moore, J. Vis. Exp. (2011) per descrizioni più dettagliate.

1. Seziona larva in soluzione salina fredda

  1. Preparare una diluizione di lavoro di HL3.1 soluzione salina o fredda Ca2+-free HL3.1 salina(Tabella 1). Mettere la larva in una piastra di elastomero siliconico con una salina appena sufficiente per coprire il fondo del piatto.
    NOTA: Si consiglia di sperimentare l'uso della salina Ca2+-free HL3.1 rispetto alla salina standard HL3.1 durante la dissezione larvale. In assenza di calcio, le contrazioni muscolari larvali sono notevolmente ridotte. Pertanto, i filetti larvali possono essere più facili da manipolare sezionati in HL3.1 senza Ca2+. Tuttavia, scopriamo che la contrazione muscolare crea spazio tra il muscolo e l'epidermide e questo può facilitare l'inserimento di forcep tra questi tessuti riducendo al minimo il rischio di danni all'epidermide. Di conseguenza, l'HL3.1 standard può essere preferibile per preservare l'integrità dell'epidermide e dei neuroni da. Otteniamo buoni risultati sia con la soluzione salina che con la scelta lasciata all'utente.
  2. Posizionare la larva con il lato ventrale verso l'alto. La superficie ventrale della larva può essere identificata dalle cinture denticali addominali e dal lato dorsale dai tubi tracheali larvali primari che corrono da anteriori a posteriori. Allungare la larva nella direzione anteriore-posteriore e inchiodare la testa e la coda a una sezionazione di elastomero in silicone usando spille per insetti. Utilizzare forbici per sezionare finemente per tagliare lungo la linea mediana ventrale, iniziando da un'estremità e progredendo verso l'altra.
    NOTA: Questo orientamento preserva l'ammasso dorsale comunemente studiato dei neuroni da.
  3. Dopo che la larva è stata tagliata aperta, inchiodare i quattro angoli al piatto di sezionazione come se aprissi un libro. Usa le forcep per afferrare e rimuovere gli organi interni tra cui il SNC, l'intestino e la trachea. Regolare i perni degli insetti in modo che il filetto sia teso ma non allungato al massimo.
    NOTA: I muscoli sono ancorati alla parete corporea ai confini segmentali. Sebbene i muscoli coprano la maggior parte della parete corporea, sono assenti in una regione stretta vicino alla linea mediana dorsale.

2. Rimozione muscolare

  1. Individuare la linea mediana dorsale della larva, dove il tessuto muscolare è assente. Posizionare una singola pinta in modo che possa essere inserita sotto il tessuto muscolare nel più piatto orientamento possibile.
  2. Partendo dalla linea mediana dorsale, vicino al confine anteriore del segmento, far scorrere attentamente le pini che provengono tra il muscolo e l'epidermide, facendo attenzione a ridurre al minimo il contatto tra le pinie e l'epidermide.
  3. Tirare le forcep verso l'alto per rompere l'attacco del muscolo alla parete del corpo in un punto di ancoraggio. Ripetere questo processo per i restanti emi-segmenti di interesse.
    NOTA: Questo protocollo ottimizza la conservazione del posteriore di ogni campo di dendrite neuronale da. Per preservare la parte anteriore del campo di dendrite, è meglio inserire le pini prong all'estremità posteriore di ogni segmento.
  4. Riregolare i perni degli insetti in modo che il filetto larvale sia allungato al massimo in tutte le direzioni.
  5. Fissare il filetto mentre è ancora appuntato sul piatto di sezionamento utilizzando formaldeide fredda e preparata al momento al 4% in PBS per 25 minuti.
  6. Risciacquare 5 volte in PBS.
  7. Utilizzare le forcelle per allontanare con cura il tessuto muscolare dai punti di ancoraggio rimanenti, facendo attenzione a ridurre al minimo il contatto con l'epidermide.
  8. Rimuovere il filetto dalla sezionatura in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml. Eseguire tutti i passaggi successivi di lavaggio, blocco e colorazione immunofluorescenza, come descritto in precedenza in Karim e Moore, J. Vis. Exp. (2011).

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Representative Results

Figure 1
Figura 1: Panoramica della procedura di rimozione muscolare. Una larva viene sezionata e appuntata su un piatto di sezionatura di elastomero siliconico. Per rimuovere il tessuto muscolare, viene inserito un punto di forza tra lo strato muscolare e quello delle cellule epidermiche, a partire dalla linea mediana dorsale vicino a un limite di segmento (2.2). Le forcep vengono tirate verso l'alto per rompere l'attacco tra il muscolo e la parete corporea (2.3). Questo viene ripetuto per segmenti di interesse e quindi la larva è fissata in formaldeide (2.5). Dopo la fissazione, le flessori vengono utilizzate per separare il tessuto muscolare rimanente dalla parete corporea (2.7 - 2.8) La cuticola larvale e l'epidermide sono raffigurate in arancione, i neuroni da di classe IV in verde e i muscoli in rosso. Gli inserti in (2.2) e (2.7) rappresentano viste trasversali di un singolo emi-segmento larvale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1x HL3.1 salina (pH 7.2)
5 mM HEPES
70 mM NaCl
5 mM KCl
CaCl2 da 1,5 mM (ometti per salina senza Ca2+)
4 mM MgCl2
10 mM NaHCO3
Trealosio da 5 mM
Saccarosio da 115 mM
Filtrare sterilizzare e conservare a 4 °C
Nota: La composizione imita l'emolinfa degli insetti

Tabella 1: Composizione della salina fredda.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 tweezers Electron Microscopy Sciences 72701-D
Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips World Precision Instruments 14003
Sylgard 184 silicone elastomer kit Dow Corning 3097358-1004 for dissecting plates
Austerlitz insect pins, 0.1 mm Fine Science Tools 26002-10
Fostec 8375 light source Artisan Technology Group 62792-4

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