Préparation des filets larvaires : une méthode pour visualiser les neurones sensoriels intacts et les cellules épidermiques associées

Overview

Cette vidéo décrit comment préparer les filets larvaires utilisés pour visualiser les neurones sensoriels d’arborisation dendritique (da) et leurs cellules épidermiques associées. Le protocole présenté montre en détail comment enlever le tissu musculaire de la paroi du corps tout en préservant la morphologie des cellules, ce qui améliore l’immunostaining et la visualisation des neurones da autrement obscurcis et des cellules épidermiques.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Tenenbaum et Gavis, Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells, J. Vis. Exp. (2016).

REMARQUE: La procédure d’ablation musculaire( figure 1) est une modification des méthodes précédemment décrites pour la préparation des filets larvaire. Les étapes qui précèdent et suivent l’ablation musculaire sont décrites brièvement et le lecteur est renvoyé à des travaux antérieurs dans Brent, et coll., J. Vis. Exp. (2009) et Karim et Moore, J. Vis. Exp. (2011) pour des descriptions plus détaillées.

1. Disséquer la larve en saline froide

1. Préparez une dilution de travail de HL3.1 froid salin ou froid Ca²⁺-libre HL3.1 saline (Tableau 1). Placez la larve dans un plat élastomer en silicone avec juste assez de solution saline froide pour couvrir le fond du plat.
   REMARQUE: Nous recommandons d’expérimenter avec l’utilisation de Ca²⁺-libre HL3.1 saline par rapport à la norme HL3.1 saline pendant la dissection larvaire. En l’absence de calcium, les contractions musculaires larvaire sont considérablement réduites. Ainsi, les filets larvaux peuvent être plus faciles à manipuler lorsqu’ils sont disséqués dans ca²⁺-libre HL3.1 saline. Cependant, nous constatons que la contraction musculaire crée de l’espace entre le muscle et l’épiderme, ce qui peut faciliter l’insertion de forceps entre ces tissus tout en minimisant le risque de dommages à l’épiderme. En conséquence, HL3.1 standard peut être préférable pour préserver l’intégrité de l’épiderme et des neurones da. Nous obtenons de bons résultats avec l’un ou l’autre salin et le choix est laissé à l’utilisateur.
2. Placez la larve avec le côté ventral vers le haut. La surface ventrale de la larve peut être identifiée par les ceintures dentaires abdominales et le côté dorsal par les tubes trachéaux larvaires primaires fonctionnant de l’antérieur au postérieur. Étirez la larve dans la direction antérieure-postérieure et épinglez la tête et la queue à un plat disséquant l’élastomer de silicone à l’aide d’épingles à insectes. Utilisez de fines ciseaux disséquants pour couper le long de la ligne médiane ventrale, en commençant à une extrémité et en progressant vers l’autre.
   REMARQUE: Cette orientation préserve le groupe dorsal communément étudié de neurones da.
3. Une fois la larve ouverte, épinglez les quatre coins du plat disséquant comme s’il ouvrait un livre. Utilisez des forceps pour saisir et enlever les organes internes, y compris le SNC, l’intestin et la trachée. Ajustez les broches d’insectes de façon à ce que le filet soit tendu, mais pas étiré au maximum.
   REMARQUE: Les muscles sont ancrés à la paroi du corps à des limites segmentales. Bien que les muscles couvrent la majeure partie de la paroi du corps, ils sont absents dans une région étroite près de la ligne médiane dorsale.

2. Ablation musculaire

1. Localiser la ligne médiane dorsale de la larve, où le tissu musculaire est absent. Placez une pince à force unique de telle sorte qu’elle puisse être insérée sous le tissu musculaire dans l’orientation la plus plate possible.
2. À partir de la ligne médiane dorsale, près de la limite antérieure du segment, faites glisser soigneusement les pinces de force entre le muscle et l’épiderme, en prenant soin de minimiser le contact entre les forceps et l’épiderme.
3. Tirez les forceps vers le haut pour briser l’attachement du muscle à la paroi du corps à un point d’ancrage. Répétez ce processus pour le reste du segment hémi(s) d’intérêt.
   REMARQUE: Ce protocole optimise la préservation du postérieur de chaque champ de dendrite de neurone da. Pour préserver la partie antérieure du champ de dendrite, il est préférable d’insérer la pince de forceps à l’extrémité postérieure de chaque segment.
4. Réajustez les épingles à insectes de telle sorte que le filet larvaire soit étiré au maximum dans toutes les directions.
5. Fixer le filet pendant qu’il est encore épinglé sur le plat de dissecting à l’aide de formaldéhyde froid et fraîchement préparé 4% dans PBS pendant 25 min.
6. Rincer 5 fois en PBS.
7. Utilisez des forceps pour retirer soigneusement le tissu musculaire des points d’ancrage restants, en prenant soin de minimiser le contact avec l’épiderme.
8. Dépiner et retirer le filet du plat dissectant dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml. Effectuez toutes les étapes subséquentes de lavage, de blocage et d’immunofluorescence, comme décrit précédemment dans Karim et Moore, J. Vis. Exp. (2011).

Representative Results

Figure 1 : Vue d’ensemble de la procédure d’ablation musculaire. Une larve est disséquée et épinglée sur un plat disséquant de l’élastomer en silicone. Pour enlever le tissu musculaire, une pince de forceps est insérée entre le muscle et la couche épidermique de cellules, à partir de la ligne médiane dorsale près d’une limite de segment (2.2). Les forceps sont tirés vers le haut pour briser l’attachement entre le muscle et la paroi du corps (2,3). Ceci est répété pour les segments d’intérêt, puis la larve est fixée en formaldéhyde (2,5). Après fixation, les forceps sont utilisés pour séparer le tissu musculaire restant de la paroi du corps (2,7 - 2,8) La cuticule larvaire et l’épiderme sont représentés en orange, classe IV da neurones en vert, et les muscles en rouge. Les insets (2.2) et (2.7) représentent des vues transversales d’un seul segment d’hémi larvaire. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

1x HL3.1 salin (pH 7.2)

5 mM HEPES

70 mM NaCl

5 mM KCl

1,5 mM CaCl2 (omettre pour ca2 +-libre saline)

4 mM MgCl2

10 mM NaHCO3

5 mM de tréhalose

Saccharose de 115 mM

Filtre stériliser et conserver à 4 °C

Note: Composition imite l’hémolymph insecte

Tableau 1 : Composition de Cold Saline.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72701-D
Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips	World Precision Instruments	14003
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning	3097358-1004	for dissecting plates
Austerlitz insect pins, 0.1 mm	Fine Science Tools	26002-10
Fostec 8375 light source	Artisan Technology Group	62792-4