Overview
このビデオでは、感覚樹状(da)ニューロンおよびそれに関連する表皮細胞を視覚化するために使用される幼虫フィレを調製する方法について説明します。注目のプロトコルは、細胞の形態を維持しながら体壁から筋肉組織を除去する方法を詳細に示し、それ以外の場合は不明瞭なdaニューロンおよび表皮細胞の免疫染色および視覚化を改善する。
Protocol
このプロトコルは、テネンバウムとガビスからの抜粋であり、感覚ニューロンおよび表皮細胞の免疫蛍光分析のための幼虫フィレからのショウジョウバエ筋肉組織の除去、J.Vis. Exp. (2016)。
注: 筋肉除去の手順(図1)は、幼虫フィレットを調製するための先に説明した方法の修飾である。筋肉の除去に先立ち、それに従うステップは簡単に概説され、読者はブレント、 他の、J.Vis.Exp.(2009) とカリムとムーア 、J.Vis.Exp の前の作品に言及されています。(2011) より詳細な説明を参照してください。
1. 冷たい生理音の中で幼虫を解剖する
- 冷たいHL3.1生理液または冷たいCa2+-freeHL3.1生理液の働く希釈を準備する(表1)。シラミのエラストマー皿に幼虫を入れ、皿の底を覆うのに十分な冷たい生理食音を入れます。
注: 幼虫解離中にCa2+フリーHL3.1生理と標準HL3.1生理焼節の使用を試してみるのをお勧めします。カルシウムがない場合、幼虫筋収縮は大幅に減少する。したがって、幼虫フィレは、Ca2+-freeHL3.1生理液剤で解剖する際に操作が容易である可能性がある。しかし、筋肉の収縮は筋肉と表皮の間に空間を作り出し、表皮への損傷のリスクを最小限に抑えながら、これらの組織間の鉗子の挿入を容易にすることができることを発見した。その結果、標準HL3.1は、表皮およびdaニューロンの完全性を維持するために好ましいかもしれない。私たちは、生理的などちらかで良い結果を得て、選択はユーザーに委ねられます。 - 幼虫を腹側を上に置きます。幼虫の腹側表面は、前から後方に走る一次幼虫管管によって腹部の歯牙帯および後側によって識別することができる。幼虫を前部後方向に伸ばし、昆虫ピンを使ってシリコーンエラストマーの解剖皿に頭と尾を固定します。細かい解剖ハサミを使用して腹側の正線に沿って切断し、一方の端から始まり、もう一方の端に向かって進む。
注: この向きは、一般的に研究されているdaニューロンの後部クラスターを保持します。 - 幼虫を切り開いた後、四隅を解剖皿に本を開くように固定します。鉗子を使用して、CNS、腸、気管などの内臓をつかんで取り除きます。フィレットが張り合っているが、最大に伸ばされていないように昆虫ピンを調整します。
注: 筋肉は、体壁の部分境界に固定されます。筋肉は体壁の大部分を覆うが、彼らは後頭線の近くの狭い領域に存在しない。
2. 筋肉除去
- 筋肉組織が存在しない幼虫の後頭中線を見つける。平坦な可能な配向で筋肉組織の下に挿入することができるように突出する単一の鉗子を配置する。
- 後頭の正線から始めて、セグメントの前部境界付近で、筋と表皮の間に突き出た鉗子を慎重にスライドさせ、鉗子と表皮の接触を最小限に抑えるように注意する。
- 鉗子を上方に引っ張って、1つのアンカーポイントで体壁への筋肉の付着を壊します。残りの目的の半セグメントに対してこのプロセスを繰り返します。
注: このプロトコルは、各daニューロンデンドライトフィールドの後部の保存を最適化します。樹状突起フィールドの前部を保持するには、各セグメントの後端に鉗子を挿入するのが最善です。 - 幼虫フィレットが最大限に伸長するように昆虫ピンを再調整します。
- それは25分間PBSで冷たく、作りたての4%ホルムアルデヒドを使用して、まだ解剖皿に固定されている間、フィレを固定します。
- PBSで5回すすいでください。
- 鉗子を使用して、残りのアンカーポイントから筋肉組織を慎重に引き離し、表皮との接触を最小限に抑えるように注意してください。
- 解剖皿から1.5mlマイクロ遠心分離チューブにフィレを外し、取り除きます。カリムおよびムーア、J.Vis.Exp に記載されているように、その後のすべての洗浄、ブロッキング、および免疫蛍光染色手順を実行します。(2011).
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Representative Results
図1:筋除去手順の概要 幼虫を解剖し、シリコーンエラストマーの解剖皿に固定します。筋肉組織を除去するために、1つの鉗子が、セグメント境界(2.2)に近い下線から始まる、筋肉と表皮細胞層の間に挿入される。鉗子は筋肉と体壁の間の付着を壊すために上に引っ張られる(2.3)。これは、関心のあるセグメントのために繰り返され、その後、幼虫はホルムアルデヒド(2.5)に固定されています。固定後、鉗子を使用して残りの筋肉組織を体壁から分離します(2.7 - 2.8)幼虫のキューティクルと表皮はオレンジ色、緑色のクラスIVダニューロン、赤の筋肉で描かれています。(2.2)と(2.7)のインセットは、単一の幼虫ヘミセグメントの断面図を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 1x HL3.1 生理液 (pH 7.2) |
| 5 mM ヘペス |
| 70 mM ナクル |
| 5 mM KCl |
| 1.5 mM CaCl2 (Ca2+フリー生理焼節については省略) |
| 4 mM MgCl2 |
| 10 mM ナフコ3 |
| 5 mM トレハロース |
| 115 mM スクロース |
| フィルター滅菌し、4 °Cで保存 |
| 注:組成物は昆虫のヘモリンフを模倣する |
表1:冷間生理の構成
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 |
