Preparação do filé larval: um método para visualizar neurônios sensoriais intactos e células epidérmicas associadas

Overview

Este vídeo descreve como preparar filés larvais usados para visualizar neurônios de arborização dendrítica sensorial (da) e suas células epidérmicas associadas. O protocolo em destaque mostra em detalhes como remover tecido muscular da parede do corpo, preservando a morfologia das células, o que melhora a imunostaining e a visualização dos neurônios e células epidérmicas obscurecidas.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Tenenbaum e Gavis, Remoção de Tecido Muscular Drosophila de Filés Larval para Análise de Imunofluorescência de Neurônios Sensoriais e Células Epidérmicas, J. Vis. Exp. (2016).

NOTA: O procedimento de remoção muscular (Figura 1) é uma modificação dos métodos descritos anteriormente para o preparo de filés larvais. As etapas que precedem e seguem a remoção muscular são delineadas brevemente e o leitor é encaminhado para trabalhos anteriores em Brent, et al., J. Vis. Exp. (2009) e Karim and Moore, J. Vis. Exp. (2011) para descrições mais detalhadas.

1. Dissecar larva em soro fisiológico

1. Prepare uma diluição de trabalho de soro fisiológico hl3.1 frio ou frio Ca²⁺-livre HL3.1 soro fisiológico(Tabela 1). Coloque a larva em um prato de elastômero de silicone com salina fria suficiente para cobrir o fundo do prato.
   NOTA: Recomendamos experimentar o uso de soro fisiológico HL3.1 livre de Ca²⁺versus soro fisiológico padrão HL3.1 durante a dissecção larval. Na ausência de cálcio, as contrações musculares larvais são muito reduzidas. Assim, os filés larvais podem ser mais fáceis de manipular quando dissecados em soro fisiológico HL3.1 livre de Ca²⁺. No entanto, descobrimos que a contração muscular cria espaço entre o músculo e a epiderme e isso pode facilitar a inserção de fórceps entre esses tecidos, minimizando o risco de danos à epiderme. Como resultado, o HL3.1 padrão pode ser preferível para preservar a integridade da epiderme e dos neurônios. Obtemos bons resultados com soro fisiológico e a escolha é deixada ao usuário.
2. Posicione a larva com o lado ventral para cima. A superfície ventral da larva pode ser identificada pelos cintos dentical abdominal e pelo lado dorsal pelos tubos traqueais larvais primários que vão de anterior a posterior. Estique a larva na direção anterior-posterior e fixe a cabeça e a cauda em um prato de dissecação de elastômero de silicone usando pinos de inseto. Use uma tesoura de dissecação fina para cortar ao longo da linha média ventral, começando em uma extremidade e progredindo em direção à outra.
   NOTA: Essa orientação preserva o aglomerado dorsal comumente estudado dos neurônios.
3. Depois que a larva é cortada, fixar os quatro cantos para o prato de dissecação como se abrisse um livro. Use fórceps para agarrar e remover órgãos internos, incluindo o CNS, intestino e traqueia. Ajuste os pinos de inseto para que o filé esteja esticado, mas não esticado ao máximo.
   NOTA: Os músculos estão ancorados na parede do corpo em limites segmentais. Embora os músculos cubram a maior parte da parede do corpo, eles estão ausentes em uma região estreita perto da linha média dorsal.

2. Remoção muscular

1. Localize a linha dorsal da larva, onde o tecido muscular está ausente. Posicione um único pino fórceps de tal forma que possa ser inserido sob o tecido muscular na orientação mais plana possível.
2. Começando na linha média dorsal, perto do limite anterior do segmento, deslize cuidadosamente o pino fórceps entre o músculo e a epiderme, tomando o cuidado de minimizar o contato entre as fórceps e a epiderme.
3. Puxe os fórceps para cima para quebrar o acessório do músculo à parede do corpo em um ponto de ancoragem. Repita este processo para o restante do segmento hemi(s) de interesse.
   NOTA: Este protocolo otimiza a preservação do posterior de cada campo de dendrite do neurônio. Para preservar a parte anterior do campo de dendrite, é melhor inserir o pino de fórceps na extremidade posterior de cada segmento.
4. Reajuste os pinos de insetos de modo que o filé larval seja esticado ao máximo em todas as direções.
5. Fixar o filé enquanto ele ainda está preso ao prato de dissecação usando frio, recém-preparado 4% formaldeído em PBS por 25 min.
6. Enxágüe 5 vezes em PBS.
7. Use fórceps para retirar cuidadosamente o tecido muscular dos pontos de ancoragem restantes, tomando o cuidado de minimizar o contato com a epiderme.
8. Despreense e remova o filé do prato de dissecação para um tubo de microcentrifuge de 1,5 ml. Realize todas as etapas subsequentes de lavagem, bloqueio e coloração de imunofluorescência, como descrito anteriormente em Karim e Moore, J. Vis. Exp. (2011).

Representative Results

Figura 1: Visão geral do procedimento de remoção muscular. Uma larva é dissecada e presa a um prato de dissecação de elastômero de silicone. Para remover o tecido muscular, um pino fórceps é inserido entre a camada muscular e epidérmica celular, começando a partir da linha dorsal média perto de um limite de segmento (2.2). Os fórceps são puxados para cima para quebrar o acessório entre o músculo e a parede corporal (2.3). Isso se repete para segmentos de interesse e, em seguida, a larva é fixada em formaldeído (2,5). Após a fixação, fórceps são usados para separar o tecido muscular restante da parede do corpo (2.7 - 2.8) A cutícula larval e a epiderme são retratadas em laranja, classe IV dos neurônios em verde, e músculos em vermelho. Os insets em (2.2) e (2.7) representam visões transversais de um único segmento de hemi larval. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1x HL3.1 soro fisiológico (pH 7.2)

5 mM HEPES

70 mM NaCl

5 mM KCl

1,5 mM CaCl2 (omitir para soro fisiológico sem ca2+)

4 mM MgCl2

10 mM NaHCO3

Trehalose de 5 mM

115 mM de sacarose

Filtrar esterilizar e armazenar a 4 °C

Nota: Composição imita hemíglifo de inseto

Tabela 1: Composição de Soro fisiológico.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72701-D
Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips	World Precision Instruments	14003
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning	3097358-1004	for dissecting plates
Austerlitz insect pins, 0.1 mm	Fine Science Tools	26002-10
Fostec 8375 light source	Artisan Technology Group	62792-4