Overview
이 비디오는 감각 수지상 식수 (da) 뉴런과 관련 표피 세포를 시각화하는 데 사용되는 애벌레 필레를 준비하는 방법을 설명합니다. 특징적인 프로토콜은 세포의 형태를 보존하는 동안 바디 벽에서 근육 조직을 제거하는 방법을 자세히 보여줍니다, 이는 면역 염색및 그렇지 않으면 가려진 다 뉴런및 표피 세포의 시각화를 향상.
Protocol
이 프로토콜은 테넨바움과 Gavis에서 발췌, 감각 신경 및 표피 세포의 면역 불피성 분석을 위한 Larval Fillets에서 Drosophila 근육 조직의 제거, J. Vis. Exp. (2016).
참고: 근육 제거절차(도 1)는애벌레 필렛을 준비하는 방법에 대한 이전에 설명된 방법의 수정이다. 근육 제거에 앞서 따르는 단계는 간략하게 설명되어 있으며 독자는 브렌트, 외, J. Vis. Exp. (2009) 및 카림과 무어, J. Vis. Exp의 이전 작품을 언급합니다. (2011) 자세한 설명.
1. 차가운 식염수의 애벌레를 해부
- 차가운 HL3.1 식염수 또는 콜드 Ca2 +-무료 HL3.1 식염수(표 1)의작업 희석을 준비합니다. 유충을 실리콘 엘라스토머 접시에 차가운 식염수로 놓아 접시 바닥을 덮습니다.
참고: 우리는 애벌레 해부 동안 표준 HL3.1 식염수 대 Ca2 +-무료 HL3.1 식염수의 사용을 실험하는 것이 좋습니다. 칼슘이 없으면 애벌레 근육 수축이 크게 줄어듭니다. 따라서, 애벌레 필렛은 Ca2+-free HL3.1 식염수에서 해부될 때 조작하기 쉬울 수 있다. 그러나, 우리는 근육 수축근육과 표피 사이 공간을 생성 하 고이 표피에 손상의 위험을 최소화 하는 동안 이러한 조직 사이 집게의 삽입을 촉진할 수 있습니다 발견. 그 결과, 표준 HL3.1은 표피와 다뉴런의 무결성을 보존하는 것이 바람직할 수 있다. 우리는 식염수와 좋은 결과를 얻고 선택은 사용자에게 맡는다. - 복부 쪽을 위로 놓습니다. 애벌레의 복부 표면은 전방에서 후방으로 실행되는 1 차적인 애벌레 기관관에 의해 복부 덴티컬 벨트 및 등쪽측에 의해 확인될 수 있습니다. 앞쪽 후방 방향으로 유충을 스트레칭하고 머리와 꼬리를 곤충 핀을 사용하여 실리콘 탄성탄을 해부하는 접시에 고정합니다. 미세 해부 가위를 사용하여 복부 미드라인을 따라 자르고 한쪽 끝에서 시작하여 다른 쪽으로 진행합니다.
참고: 이 방향은 다 뉴런의 일반적으로 연구 된 등쪽 클러스터를 보존합니다. - 애벌레가 잘려낸 후, 책을 여는 것처럼 해부 접시에 네 모서리를 고정합니다. 집게를 사용하여 CNS, 창자 및 기관을 포함한 내부 장기를 잡고 제거하십시오. 필렛이 팽팽하지만 최대적으로 늘어나지 않도록 곤충 핀을 조정합니다.
참고: 근육은 세그먼트 경계에서 신체 벽에 고정됩니다. 근육은 바디 월의 대부분을 커버하더라도, 그(것)들은 등쪽 미드라인 근처 좁은 지역에 없습니다.
2. 근육 제거
- 근육 조직이 없는 애벌레의 등간 미드라인을 찾습니다. 단일 포셉프프를 배치하여 가능한 단평한 방향으로 근육 조직 아래에 삽입할 수 있도록 합니다.
- 세그먼트의 전방 경계 근처의 등갈 미드라인에서 시작하여 근육과 표피 사이의 집게갈을 조심스럽게 밀어 내어 집게와 표피 사이의 접촉을 최소화합니다.
- 한 앵커 포인트에서 근육의 부착을 신체 벽에 부수도록 위쪽으로 집게를 당깁니다. 나머지 헤미 세그먼트에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
참고: 이 프로토콜은 각 다뉴런 점막 장의 후방 보존을 최적화합니다. 원원수 필드의 전방 부분을 보존하려면 각 세그먼트의 후부 끝에 포셉프를 삽입하는 것이 가장 좋습니다. - 애벌레 필렛이 모든 방향으로 최대로 뻗어 있도록 곤충 핀을 다시 조정합니다.
- 25분 동안 PBS에서 차갑고 갓 준비된 포름알데히드를 사용하여 해부 접시에 고정되어 있는 동안 필렛을 고정합니다.
- PBS에서 5번 헹구습니다.
- 집게를 사용하여 나머지 앵커 포인트에서 근육 조직을 조심스럽게 꺼내표피와의 접촉을 최소화하십시오.
- 1.5 ml 마이크로 센심 분리튜브에 해부 접시에서 필렛을 분리합니다. 이전에 카림과 무어,J. Vis. Exp에 설명된 것처럼 모든 후속 세척, 차단 및 면역 형광 염색 단계를 수행합니다. (2011).
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Representative Results
그림 1: 근육 제거 절차 개요. 유충은 해부되고 실리콘 엘라스토머 해부 접시에 고정됩니다. 근육 조직을 제거하기 위해, 하나의 포스프 프롱은 근육과 표피 세포 층 사이에 삽입되며 세그먼트 경계 (2.2) 근처의 등쪽 미드 라인에서 시작됩니다. 집게는 근육과 신체 벽 (2.3) 사이의 부착을 깨기 위해 위쪽으로 당겨. 이것은 관심있는 세그먼트에 대해 반복되고 유충은 포름알데히드 (2.5)로 고정됩니다. 고정 후, 집게는 바디 벽에서 나머지 근육 조직을 분리하는 데 사용됩니다 (2.7 - 2.8) 애벌레 표피와 표피는 오렌지, 녹색의 클래스 IV 다 뉴런, 빨간색 근육으로 묘사된다. (2.2) 및 (2.7)의 인셋은 단일 애벌레 헤미 세그먼트의 단면 보기를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 1x HL3.1 식염수 (pH 7.2) |
| 5 mM 헤페 |
| 70 mM NaCl |
| 5mM KCl |
| 1.5 mM CaCl2 (Ca2+무료 식염수로 생략) |
| 4 mM MgCl2 |
| 10mM 나코3 |
| 5 mM 트레할로오스 |
| 115 mM 자당 |
| 필터 살균 및 저장 4°C |
| 참고: 조성은 곤충 혈류를 모방 |
표 1: 차가운 식염수의 구성.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 |
