Ларвал Филе Подготовка: Метод визуализации Intact сенсорных нейронов и связанных эпидермальных клеток

Overview

Это видео описывает, как подготовить филе личинок, используемых для визуализации сенсорных дендритных арборизации (да) нейронов и связанных с ними эпидермальных клеток. Рекомендуемый протокол подробно показывает, как удалить мышечную ткань со стенки тела, сохраняя при этом морфологию клеток, которая улучшает иммуностеинирование и визуализацию скрытых в противном случае да нейронов и эпидермальных клеток.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Тененбаум и Гавис, Удаление Drosophila мышечной ткани из larval Филе для иммунофторесценции Анализ сенсорных нейронов и эпидермальных клеток, J. Vis. Exp. (2016).

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура удаления мышц (рисунок1) является модификацией ранее описанных методов приготовления филе личинок. Шаги, которые предшествуют и следуют мышечной удаления изложены кратко и читатель относится к предыдущей работе в Брент, и др., J. Vis. Exp. (2009) и Карим и Мур, J. Vis. Exp. (2011) для более подробных описаний.

1. Вскрыть Ларву в холодном солевом растворе

1. Подготовка рабочего разбавления холодного HL3.1 солевой^{или холодный}Ca 2 "-бесплатный HL3.1 солевой раствор (Таблица 1). Поместите личинку в силиконовое блюдо ерастомера с достаточно холодным солевым раствором, чтобы покрыть дно блюда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем экспериментировать с использованием^{соляного раствора}HL3.1 без ХЛ3.1 по сравнению со стандартным солевым раствором HL3.1 во время вскрытия личинок. При отсутствии кальция значительно сокращаются личиночные мышечные сокращения. Таким образом, филе личинки может быть легче манипулировать при вскрытии в Ca²"-бесплатный HL3.1 солевой раствор. Тем не менее, мы находим, что сокращение мышц создает пространство между мышцами и эпидермисом, и это может облегчить вставку миппов между этими тканями при минимизации риска повреждения эпидермиса. В результате, стандартные HL3.1 могут быть предпочтительнее для сохранения целостности эпидермиса и да нейронов. Мы получаем хорошие результаты либо с физраствором, и выбор остается за пользователем.
2. Распоить личинку с брюшной стороной вверх. Вентральная поверхность личинки может быть идентифицирована по брюшным дентическим поясам и спинной стороне первичными личиночных трахеальных трубок, испеханых от передней до задней. Растянуть личинки в передней-задней направлении и приколоть голову и хвост к силиконовой эластомер вскрытия блюдо с помощью насекомых булавки. Используйте тонкие рассекая ножницы, чтобы сократить вдоль брюшной средней линии, начиная с одного конца и прогрессирует в сторону другого.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта ориентация сохраняет общепринято изученный спинной кластер да нейронов.
3. После того, как личинка разрезается, прикрепите четыре угла к рассечению блюдо, как будто открывая книгу. Используйте типсы, чтобы захватить и удалить внутренние органы, включая ЦНС, кишечник и трахею. Отрегулируйте булавки насекомых так, чтобы филе было натянутым, но не максимально растянутым.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мышцы закреплены на стене тела на сегментальных границах. Хотя мышцы покрывают большую часть стенки тела, они отсутствуют в узкой области вблизи спинной средней линии.

2. Удаление мышц

1. Найдите спинную середину личинки, где отсутствует мышечная ткань. Позиция одного зубца щипцов таким образом, что он может быть вставлен под мышечной ткани в плоской возможной ориентации.
2. Начиная с спинной средней линии, вблизи передней границы сегмента, тщательно сдвиньте щипцы зубец между мышцей и эпидермисом, заботясь, чтобы свести к минимуму контакт между щипцами и эпидермисом.
3. Потяните типсы вверх, чтобы сломать привязанность мышцы к стене тела в одной точке якоря. Повторите этот процесс для остальных геми-сегмента (ы) интереса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оптимизирует сохранение задней каждого да нейрона дендритного поля. Чтобы сохранить переднюю часть дендритного поля, лучше всего вставить зубец щипцов на задней части каждого сегмента.
4. Перенастраить насекомых булавки таким образом, что филе личинки максимально растягивается во всех направлениях.
5. Исправить филе, пока он по-прежнему возлагали на рассечение блюдо с использованием холодного, свежеприготовленного 4% формальдегида в PBS в течение 25 минут.
6. Промыть 5 раз в PBS.
7. Используйте типсы, чтобы тщательно вытащить мышечную ткань из оставшихся точек якоря, заботясь, чтобы свести к минимуму контакт с эпидермисом.
8. Отсоедить и удалить филе из рассечения блюдо в 1,5 мл микроцентрифуг трубки. Выполните все последующие шаги по мытью, блокированию и окрашиванию иммунофлюоресценции, как это было описано ранее в Karim иMoore, J. Vis. Exp. (2011).

Representative Results

Рисунок 1: Обзор процедуры удаления мышц. Личинка вскрывается и прикрепляется к силиконовому еластомеру, рассекая блюдо. Для удаления мышечной ткани между слоем мышц и эпидермальных клеток вставляется один зубец щипцов, начиная с спинной средней линии вблизи границы сегмента (2,2). Миппы вытягиваются вверх, чтобы сломать крепление между мышцей и стеной тела (2,3). Это повторяется для сегментов интереса, а затем личинка фиксируется в формальдегиде (2,5). После фиксации, миппы используются для отделить оставшиеся мышечной ткани от стенки тела (2,7 - 2,8) личинки кутикулы и эпидермиса изображены в оранжевый, класс IV да нейронов в зеленом, и мышцы красного цвета. В сеточки в (2.2) и (2.7) представляют собой поперечные представления одного личинок-геми-сегмента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

1x HL3.1 солевой раствор (рН 7,2)

5 мМ HEPES

70 мМм НаКл

5 мММ ККл

1.5 mM CaCl2 (опустить для ca2'-бесплатный солевой раствор)

4 мМ MgCl2

10 мМ НаХКО3

Трегалоза 5 мМ

115 мм сахароза

Фильтр стерилизовать и хранить при 4 градусах Цельсия

Примечание: Композиция имитирует гемолимфу насекомых

Таблица 1: Состав холодного солевого раствора.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72701-D
Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips	World Precision Instruments	14003
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning	3097358-1004	for dissecting plates
Austerlitz insect pins, 0.1 mm	Fine Science Tools	26002-10
Fostec 8375 light source	Artisan Technology Group	62792-4