Larval Fillet Preparation: Eine Methode zur Visualisierung intakter sensorischer Neuronen und assoziierter epidermaler Zellen

Overview

Dieses Video beschreibt, wie Larvenfilets vorbereitet werden, die verwendet werden, um sensorische dendritische Arborisation (da) Neuronen und die zugehörigen epidermalen Zellen zu visualisieren. Das vorgestellte Protokoll zeigt im Detail, wie Muskelgewebe aus der Körperwand entfernt wird, während die Morphologie der Zellen erhalten bleibt, was die Immunfärbung und Visualisierung der ansonsten verdeckten Da-Neuronen und epidermalen Zellen verbessert.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Tenenbaum und Gavis, Entfernung von Drosophila Muskelgewebe aus Larval Fillets für Immunfluoreszenzanalyse von sensorischen Neuronen und Epidermalzellen, J. Vis. Exp. (2016).

HINWEIS: Das Verfahren zur Muskelentfernung (Abbildung 1) ist eine Modifikation der zuvor beschriebenen Methoden zur Herstellung von Larvenfilets. Die Schritte, die der Muskelentfernung vorausgehen und folgen, werden kurz beschrieben und der Leser wird auf frühere Arbeiten in Brent, et al., J. Vis. Exp. (2009) und Karim und Moore, J. Vis. (2011) für detailliertere Beschreibungen.

1. Sezieren Larve in kalter Saline

1. Bereiten Sie eine Arbeitsverdünnung der kalten HL3.1 Kochin oder kalt Ca²⁺-frei HL3.1 Kochstoff (Tabelle 1). Legen Sie die Larve in eine Silikon-Elastomerschale mit gerade genug kalter Wäsche, um den Boden der Schale zu bedecken.
   HINWEIS: Wir empfehlen, mit der Verwendung von Ca²⁺-frei HL3.1-Saline im Vergleich zu Standard-HL3.1-Saline während der Larvensektion zu experimentieren. In Abwesenheit von Kalzium, LarvenmuskelKontraktionen sind stark reduziert. So können Larvenfilets leichter zu manipulieren sein, wenn sie in Ca²⁺-freier HL3.1-Saline seziert werden. Jedoch, Wir finden, dass Muskelkontraktion schafft Raum zwischen dem Muskel und Epidermis und dies kann das Einsetzen von Zangen zwischen diesen Geweben erleichtern, während das Risiko einer Schädigung der Epidermis zu minimieren. Daher kann Standard-HL3.1 vorzuziehen sein, um die Integrität der Epidermis und da Neuronen zu erhalten. Wir erzielen gute Ergebnisse mit entweder saline und die Wahl bleibt dem Benutzer überlassen.
2. Positionieren Sie die Larve mit der ventralen Seite nach oben. Die ventrale Oberfläche der Larve kann durch die abdominalen Dentical-Gürtel und die rückenförmige Seite durch die primären Larven-Trachealröhren identifiziert werden, die von vorder nach hinten laufen. Dehnen Sie die Larve in vorderer-posterior Richtung und heften Sie Kopf und Schwanz mit Insektenstiften an eine Silikon-Elastomer-Sezierenschale. Verwenden Sie eine feine Sezierendereine, um entlang der ventralen Mittellinie zu schneiden, beginnend an einem Ende und in Richtung des anderen.
   HINWEIS: Diese Ausrichtung bewahrt den häufig untersuchten dorsalen Cluster von Da-Neuronen.
3. Nachdem die Larve aufgeschnitten ist, stecken Sie die vier Ecken an die Sezierende Schale, als ob sie ein Buch öffnen würde. Verwenden Sie Zangen, um innere Organe einschließlich der ZNS, Darm, und Luftröhre zu greifen und zu entfernen. Stellen Sie Insektenstifte so ein, dass das Filet straff, aber nicht maximal gestreckt ist.
   HINWEIS: Die Muskeln sind an segmentalen Grenzen an der Körperwand verankert. Obwohl Muskeln den größten Teil der Körperwand bedecken, fehlen sie in einem engen Bereich in der Nähe der dorsalen Mittellinie.

2. Muskelentfernung

1. Suchen Sie die dorsale Mittellinie der Larve, wo Muskelgewebe fehlt. Positionieren Sie eine einzelne Zange so, dass sie in der flachsten möglichen Ausrichtung unter das Muskelgewebe eingeführt werden kann.
2. Beginnend an der dorsalen Mittellinie, in der Nähe der vorderen Grenze des Segments, schieben Sie vorsichtig die Zangen prong zwischen dem Muskel und Epidermis, wobei darauf geachtet wird, den Kontakt zwischen den Zangen und epidermis zu minimieren.
3. Ziehen Sie die Zange nach oben, um die Befestigung des Muskels an der Körperwand an einem Ankerpunkt zu brechen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Hemi-Segmente von Interesse.
   HINWEIS: Dieses Protokoll optimiert die Erhaltung des hinteren Teils jedes da Neuron Dendritfeldes. Um den vorderen Teil des Dendritenfeldes zu erhalten, ist es am besten, die Zange prong am hinteren Ende jedes Segments einzufügen.
4. Stellen Sie Insektenstifte so wieder ein, dass das Larvenfilet maximal in alle Richtungen gestreckt ist.
5. Fixieren Sie das Filet, während es noch an der Sezierenschale mit kaltem, frisch zubereitetem 4% Formaldehyd in PBS für 25 min gepinnt ist.
6. 5 Mal in PBS abspülen.
7. Verwenden Sie Zangen, um Muskelgewebe vorsichtig von den verbleibenden Ankerpunkten zu entfernen, wobei darauf geachtet wird, den Kontakt mit der Epidermis zu minimieren.
8. Lösen Sie das Filet aus der Sezierenderschale in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Führen Sie alle nachfolgenden Wasch-, Blockierungs- und Immunfluoreszenzfärbungsschritte durch, wie zuvor in Karim und Moore, J. Vis. Exp beschrieben. (2011).

Representative Results

Abbildung 1: Übersicht über die Muskelentfernung. Eine Larve wird seziert und an eine Silikon-Elastomer-Sezieren-Schale gepinnt. Um Muskelgewebe zu entfernen, wird eine Zange prong zwischen dem Muskel und epidermalen Zellschicht eingefügt, beginnend von der dorsalen Mittellinie in der Nähe einer Segmentgrenze (2.2). Die Zange wird nach oben gezogen, um die Befestigung zwischen Muskel und Körperwand zu brechen (2.3). Dies wird für Segmente von Interesse wiederholt und dann wird die Larve in Formaldehyd (2.5) fixiert. Nach der Fixierung werden Zangen verwendet, um das verbleibende Muskelgewebe von der Körperwand zu trennen (2.7 - 2.8) Die Larvenhaut und Epidermis sind in Orange, Klasse IV da Neuronen in grün und Muskeln in Rot dargestellt. Insets in (2.2) und (2.7) stellen Querschnittsansichten eines einzelnen Larven-Hemi-Segments dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1x HL3.1 Saline (pH 7.2)

5 mM HEPES

70 mM NaCl

5 mM KCl

1,5 mM CaCl2 (wegfür Ca2+-freie Saline)

4 mM MgCl2

10 mM NaHCO3

5 mM Trehalose

115 mM Saccharose

Filter sterilisieren und bei 4 °C lagern

Hinweis: Zusammensetzung imitiert Insektenhämolympt

Tabelle 1: Zusammensetzung der kalten Saline.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72701-D
Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips	World Precision Instruments	14003
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning	3097358-1004	for dissecting plates
Austerlitz insect pins, 0.1 mm	Fine Science Tools	26002-10
Fostec 8375 light source	Artisan Technology Group	62792-4