Preparación de filetes larvarios: Un método para visualizar neuronas sensoriales intactas y células epidérmicas asociadas

Overview

Este video describe cómo preparar filetes larvarios utilizados para visualizar las neuronas de arborización dendrítica sensorial (da) y sus células epidérmicas asociadas. El protocolo destacado muestra en detalle cómo eliminar el tejido muscular de la pared del cuerpo preservando la morfología de las células, que mejora la inmunostaining y visualización de las neuronas da oscurecidas y células epidérmicas.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Tenenbaum y Gavis, Eliminación del tejido muscular de Drosophila de filetes larvarios para análisis de inmunofluorescencia de neuronas sensoriales y células epidérmicas, J. Vis. Exp. (2016).

NOTA: El procedimiento para la eliminación muscular(Figura 1)es una modificación de los métodos descritos anteriormente para preparar filetes larvarios. Los pasos que preceden y siguen la extirpación muscular se describen brevemente y el lector se refiere al trabajo anterior en Brent, et al., J. Vis. Exp. (2009) y Karim y Moore, J. Vis. (2011) para descripciones más detalladas.

1. Diseccionar larva en solución salina fría

1. Preparar una dilución de trabajo de solución salina HL3.1 fría o ca²⁺fría -sin solución salina HL3.1 (Tabla 1). Coloque la larva en un plato de elastómero de silicona con suficiente solución salina fría para cubrir la parte inferior del plato.
   NOTA: Recomendamos experimentar con el uso de Ca²⁺-free HL3.1 saline versus estándar HL3.1 saline durante la disección larvaria. En ausencia de calcio, las contracciones musculares larvarias se reducen considerablemente. Por lo tanto, los filetes larvarios pueden ser más fáciles de manipular cuando se diseccionan en Ca²⁺-free HL3.1 saline. Sin embargo, encontramos que la contracción muscular crea espacio entre el músculo y la epidermis y esto puede facilitar la inserción de fórceps entre estos tejidos mientras minimiza el riesgo de daño a la epidermis. Como resultado, estándar HL3.1 puede ser preferible para preservar la integridad de la epidermis y las neuronas. Obtenemos buenos resultados con la solución salina y la elección queda en el usuario.
2. Coloque la larva con el lado ventral hacia arriba. La superficie ventral de la larva se puede identificar por las correas denticales abdominales y el lado dorsal por los tubos traqueales larvarios primarios que van de antes a posterior. Estirar la larva en la dirección anterior-posterior y fijar la cabeza y la cola a un plato de disección de elastómero de silicona usando alfileres de insectos. Utilice tijeras diseccionantes finas para cortar a lo largo de la línea media ventral, comenzando en un extremo y progresando hacia el otro.
   NOTA: Esta orientación conserva el grupo dorsal comúnmente estudiado de las neuronas da.
3. Después de que la larva se abre, ancle las cuatro esquinas al plato de disección como si abriera un libro. Utilice fórceps para agarrar y extraer órganos internos, incluyendo el SNC, el intestino y la tráquea. Ajuste los pasadores de insectos para que el filete esté tenso pero no se extienda al máximo.
   NOTA: Los músculos están anclados a la pared del cuerpo en los límites segmentales. Aunque los músculos cubren la mayor parte de la pared del cuerpo, están ausentes en una región estrecha cerca de la línea media dorsal.

2. Eliminación muscular

1. Localice la línea media dorsal de la larva, donde el tejido muscular está ausente. Coloque una sola fórceps que se pueda insertar debajo del tejido muscular en la orientación más plana posible.
2. Comenzando en la línea media dorsal, cerca del límite anterior del segmento, deslice cuidadosamente los fórceps que se extienden entre el músculo y la epidermis, teniendo cuidado de minimizar el contacto entre los fórceps y la epidermis.
3. Tire de los fórceps hacia arriba para romper el apego del músculo a la pared del cuerpo en un punto de anclaje. Repita este proceso para los segmentos hemi restantes de interés.
   NOTA: Este protocolo optimiza la preservación del posterior de cada campo de dendrita da neuron. Para conservar la parte anterior del campo dendrita, lo mejor es insertar las fórceps puntadas en el extremo posterior de cada segmento.
4. Vuelva a ajustar los pines de insectos de manera que el filete larvario se extienda al máximo en todas las direcciones.
5. Fijar el filete mientras todavía está anclado al plato de disección usando frío, recién preparado 4% formaldehído en PBS durante 25 min.
6. Enjuague 5 veces en PBS.
7. Utilice fórceps para extraer cuidadosamente el tejido muscular de los puntos de anclaje restantes, teniendo cuidado de minimizar el contacto con la epidermis.
8. Desengancha y retira el filete del plato de disección a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Realice todos los pasos posteriores de lavado, bloqueo e tinción de inmunofluorescencia, como se describió anteriormente en Karim y Moore, J. Vis. (2011).

Representative Results

Figura 1: Descripción general del procedimiento de eliminación muscular. Una larva se disecciona y se fija a un plato de disección de elastómero de silicona. Para eliminar el tejido muscular, se inserta una punta de fórceps entre la capa muscular y la capa de células epidérmicas, comenzando desde la línea media dorsal cerca de un límite de segmento (2.2). Las fórceps se tira hacia arriba para romper el accesorio entre el músculo y la pared del cuerpo (2.3). Esto se repite para segmentos de interés y luego la larva se fija en formaldehído (2.5). Después de la fijación, los fórceps se utilizan para separar el tejido muscular restante de la pared corporal (2.7 - 2.8) La cutícula larvaria y la epidermis se representan en naranja, clase IV da neuronas en verde, y los músculos en rojo. Los insertos en (2.2) y (2.7) representan vistas transversales de un único segmento hemi larvario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1x solución salina HL3.1 (pH 7.2)

HEPES de 5 mM

70 mM NaCl

5 mM KCl

CaCl2 de 1,5 mM (omitir la solución salina sin ca2+)

4 mM MgCl2

10 mM NaHCO3

Trehalose de 5 mM

Sacarosa de 115 mM

Filtrar esterilizar y almacenar a 4 °C

Nota: La composición imita el hemolymph de insectos

Tabla 1: Composición de solución salina fría.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72701-D
Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips	World Precision Instruments	14003
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning	3097358-1004	for dissecting plates
Austerlitz insect pins, 0.1 mm	Fine Science Tools	26002-10
Fostec 8375 light source	Artisan Technology Group	62792-4